ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 13—2018 H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光 RT-PCR 检测方法 Duplex real -time RT-PCR assay for detection of avian i nfluenza A (H7N9) virus 2018 - 10 - 24发布 2018 - 10 - 24实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 13—2018 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心 本标准主要起草人： 刘玉良、王传彬、宋晓晖、吴佳俊、杨林、孙明、陈西钊、乔明明、蒋菲、顾 小雪、刘洋、张硕、韩焘、赵柏林 。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 13—2018 1 H7N9亚型禽流感病毒双重实时 荧光 RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了 H7N9亚型禽流感病毒 双重实时荧光 RT-PCR检测试剂 、仪器设备、实验操作步骤 。 本标准适用于禽组织、分泌物、排泄物和 培养物中H7N9亚型禽流感病毒 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂 3.1 RNA提取试剂 RNA提取试剂详见附录 A.1～A.4，或选取商品化的 病毒 RNA提取试剂盒。 3.2 5 × RT-PCR缓冲液 Tris base 15.14 g KCl 13.98 g MgCl 2.6H2O 1.53 g DTT 3.86 g 加无核酸酶灭菌蒸馏水 至400 mL，调 pH值至 8.3（室温下），定容至 500 mL。过滤（ 0.22 μm） 除菌后置于 2℃～8℃保存备用。 3.3. 10 × PCR 缓冲液的配制 Tris base 6.06 g KCl 18.64 g Triton X -100 5.00 mL 加无核酸酶灭菌蒸馏 水至 400 mL，用 HCl调pH值至 9.0（室温下），定容至 500 mL。高压灭菌冷却 后置于 2℃～8℃保存备用。 3.3 引物和探针 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 13—2018 2 表1 所用引物和探针 3.4 其他试剂 Taq DNA聚合酶（5U/µ L）、AMV反转录酶 （10U/µ L）、RNA酶抑制剂 （40 U/µ L）、无水乙醇 、 无核酸酶 灭菌蒸馏 水、生理盐水。 4 仪器设备 分析天平 、高速离心机 、荧光 PCR仪、组织研磨仪 、-20℃冰箱、可调移液器。 5 操作步骤 5.1 样品采集 样品采集 按照 NY/T 541 进行。对于病死 禽，取脑、肺 、气管、喉头 等组织； 对于活禽，用棉拭子 轻轻分别采集同一只禽的 咽喉分泌物 和少量泄殖腔粪便 ，放在含有保护液（ 50%甘油生理盐水）的 同一 离心管中 ，加盖，编号。 5.2 样品处理 5.2.1 组织样品 每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1 g，剪碎后取适量于研磨器中研磨，加入 1.0 mL生理 盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中， 10,000 × g 离心 2 min，取上清液 100 µ L于1.5 mL灭菌离心 管中。 5.2.2 分泌物和排泄物样品 名称 序列（ 5＇-3＇） 目的基因 HA-7-F TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCAT HA HA-7-R ACAAATAGTGCACYGCATGTTTCC HA-7-P FAM -CCATTGYAATGGGYCT -MGB NA-9-F ACACTCAAACGGAACAATACACG NA NA-9-R GACCACCCAATGCATTCCAC NA-9-P HEX -AAGCTGGCCACTATC -MGB 注1： 将表中引物和探针 均用无核酸酶 灭菌蒸馏水稀释至 10 pmol/µ L 后使用。 注2：引物序列中， R代表 A或G碱基； Y代表 C或T碱基 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 13—2018 3 将咽喉 /泄殖腔棉拭子在振荡器上 充分混合，捻动、挤压干后弃去拭子。 10,000 × g离心 5 min，吸取 上清 100 µL于1.5 mL灭菌离心管中。 5.2.3 培养物样品 将培养物 10,000 × g离心 5 min，取上清 100 µL于1.5 mL灭菌离心管中。 5.3 病毒 RNA的提取 5.3.1 若选用附录 A中所列试剂提取病毒 RNA，则参照以下 步骤进行操作 ： a) 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液 600 µ L，充分颠倒混匀，室温静置 3 min～5 min； b) 将液体吸入吸附柱中 ，10,000 × g 离心 30 s； c) 弃去收集管中液体，加入 600 µ L洗涤液， 10,000 × g 离心 30 s； d) 重复上述步骤 c）进行洗涤 ； e) 弃去收集管中液体， 10,000 × g离心 2 min，以除去残留的洗涤液； f) 将吸附柱移入新的 1.5 mL无菌离心管中， 向柱中央加入洗脱液 50 µ L， 室温静置 1 min，10,000 × g 离心 30 s，离心管中液体 为模板 RNA。 5.3.2 若使用病毒 RNA试剂盒提取病毒 RNA，则按试剂盒说明书进行操作。 5.4 双重实时荧光 RT-PCR扩增 按照表 2配制双重实时荧光 RT-PCR扩增反应体系。 表2 双重实时荧光 RT-PCR扩增反应体系 项目 试剂 体积 HA引物和探针 HA-7-F 0.80 µ L HA-7-R 0.80 µ L HA-7-P 0.80 µ L NA引物和探针 NA-7-F 0.80 µ L NA-7-R 0.80 µ L NA-7-P 0.80 µ L PCR反应溶液 无核酸酶灭菌蒸馏水 3.60 µL 5 × RT -PCR缓冲液 4.00 µ L 10 × PCR 缓冲液 2.00 µ L AMV反转录酶 0.25 µ L RNA酶抑制剂 0.15 µL Taq DNA聚合酶 0.20 µ L RNA模板 5.00 µ L 总体积 20.0 µ L 注：如仅需扩增 HA或NA基因，则选择表中扩增该基因的 相应引物和探针以及 PCR反应溶液配制反应体系， 同时增加 无菌核酸酶灭菌蒸馏水 至6.00 µ L。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 13—2018 4 将表 2中试剂加到荧光 RT-PCR反应管后， 充分混匀， 做好标记 。扩增 HA基因的荧光报告基团为 FAM， 扩增 NA的为HEX（如果仪器未经 HEX校正过，可用 VIC代替），淬灭基团 为BHQ或MGB。在荧光 PCR 仪上按表 3所示程序进行扩增 反应。 表3 荧光 RT-PCR扩增程序 5.5 荧光 RT-PCR反应对照 吸取含灭活的 H7N9亚型禽流感病毒 的鸡胚尿囊液 100 µL至1.5 mL灭菌离心管中，作为阳性对照； 吸取 SPF鸡胚尿囊液 100 µ L至1.5 mL灭菌离心管中，作为阴性对照。 各对照 RT-PCR扩增体系中，除模板 外，其余组分和 RT-PCR扩增程序与 5.4相同。 5.6 结果分析 5.6.1 实验成立条件 阳性对照 Ct值≤30并出现典型 的扩增曲线， 阴性对照无 Ct值并且无典型的 扩增曲线， 实验结果成立 ， 实例可参考附录 B.1。 5.6.2 阈值设定 阈值线设定于刚 刚超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。 5.6.3 结果判定 若被检样品 FAM荧光信号 Ct值≤30并出现典型 的扩增曲线 ，则判为H7阳性，实例可参考附录 B.2； 若被检样品 HEX荧光信号 Ct值≤30并出现典型 的扩增曲线 ，则判为N9阳性，实例可参考附录 B.3； 若被检样品 30＜Ct＜35并出现典型 的扩增曲线，需重新取样提取 RNA，扩增后进行结果判定，如 仍是可疑，可判定为阳性； 被检样品 Ct值≥35时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性； 对于某些未呈现 S型曲线，但本底较高的样品， 判为阴性。