ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 5—2018 非洲猪瘟病毒实时荧光 PCR检测方法 Real -time PCR assay for detection of African swine fever virus 2018 - 10 - 24发布 2018 - 10 - 24实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 5—2018 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心 、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医 研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所 、北京海关 。 本标准主要起草人：倪建强、 王传彬、 王琴、仇华吉、殷宏、 杨林、辛盛鹏 、刘艳华、 刘洋、宋晓 晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、 张乾义、 乔彩霞、夏应菊、 杨吉飞、 徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕 一鸣。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 5—2018 1 非洲猪瘟病毒实时荧光 PCR检测方法 1 范围 本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光 PCR检测方法的 试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实 验室生物安全等 技术要求。 本标准适用于猪 脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉 中非洲猪瘟病毒核酸 的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂 3.1 DNA提取试剂 DNA提取试剂 的配制见附录A，或选取商品化的病毒 DNA提取试剂盒并参照说明书进行 DNA提取。 3.2 2 × PCR缓冲液 2 × PCR缓冲液的配制见附录 A。 3.3 引物探针 3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒 VP72基因（核苷酸序列 见附录 B）的引物及探针 ： 上游引物 ASF-CADC -rPCRF：5'-1528 -ATAGAGATACAGCTCTTCCAG -1548 -3' 下游引物 ASF-CADC -rPCRR：5'-1660-GTA TGTAAGAGCTGCAGAAC -1679-3' 荧光探针 ASF-CADC -Probe：5'-1638 -FAM -TATCGATAAGATTGAT -MGB -1653 -3' 3.3.2 可以使用世界动物卫生组织 （OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（ Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals ）第 2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针 ，并按照手册 中规定的 检测程序和判定标准操作 ： 上游引物 ASF-OIE-rPCRF：5'-1627 -CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA -1651 -3' 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 5—2018 2 下游引物 ASF-OIE-rPCRR：5'-1857 - GATACCACAAGATC RGCCGT -1876 -3' 荧光探针 ASF-OIE-Probe：5'-1761 -FAM -CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG -TAMRA -1785 -3' 3.3.3 使用国家农业行政主管部门 批准的其他引物、探针，应对 检测程序和判定标准作相应调整 。 3.4 阴性及阳性对照 阴性及阳性对照的制备方法见附录 C。 3.5 其他试剂 消毒液、 5U/μL Taq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、 0.01mol/L PBS （pH7.2）。 消毒液配制见附录 A， 0.01mol/L PBS 配制见附录 A。 4 仪器和耗材 分析天平（感量 0.1 mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于 12 000 r/min ）、冰盒、 实 时荧光PCR仪及配套反应管 （板）、组织研磨器、 -20℃冰箱、可调移液器（ 2 µL，20 µL，200 µL，1 000 µL）、1.5 mL离心管（无核酸酶） 。 5 操作步骤 5.1 样品采集及运输 样品采集及运输 按照NY/T 541的规定执行，采集猪的 脾脏、淋巴结、血液等组织材料或 血粉用于检 测，样品应在冷藏条件下 尽快运输至实验室 ，避免反复冻融。 采样时应穿戴个人生物安全防护装备， 实 施现场消毒和废弃物处理。 5.2 样品处理 检测前样品应在二级生物安全柜中 处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加 1mL的 0.01mol/L PBS （pH7.2）制成匀浆，经 10 000 r/min离心取上清 ；全血、血清样品直接取 1mL，置于1.5 mL离心管内 盖紧管帽。将上述处理的样品 置于60℃条件下灭活30min。 5.3 样品保存 采集或处理好的样品在 2℃～8℃条件下保存应不超过 24 h；如需长期保存，应放置 -70℃冰箱，但 应避免反复冻融（冻融不超过 3次）。 5.4 病毒 DNA提取 5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒 DNA提取试剂，则按照 试剂说明书操作。 5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用 n表示，取 n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 5—2018 3 5.4.3 每管加入 200 μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各 200μL，1份 样品换用 1个吸头，混匀器上震荡混匀 5 s。于4℃～25℃条件下， 13 000 r/min离心10 min。DNA提 取液1见附录A。 5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入 10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀 5 s。于4℃～25℃条件下， 2 000 r/min 离心10 s。DNA提取液2见附录A。 5.4.5 100℃干浴或沸水浴 10 min。 5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水， 13 000 r/min 离心10 min，上清即为提取的 DNA，-20℃ 保存备用。 无DNA酶的灭菌去离子水见附录 A。 5.5 实时荧光 PCR操作 5.5.1 在反应混合物配制区、样品 制备区和检测区分别进行 5.5.2～5.5.4。 5.5.2 每个检测反应体系需使用 20μL实时荧光PCR反应液。 根据 5.4.2中设定的 n值， 按附录 D配制 反应液，充分混匀后分装，每个 PCR反应管20μL。转移PCR反应管至样品 制备区。 5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入 5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到 25 μL，记 录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。 5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入 实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定 5-羧基荧光 素（FAM）作为报告基团， 小沟结合物（ MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min； 95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环；在每次循环的 60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后， 根据收集的 Ct值和荧光曲线 判定结果。 6 结果判定 6.1 结果分析条件设定 实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增 曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数即为 Ct值。 6.2 结果描述及判定 当阳性对照 Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无 Ct值无扩增曲线时，实验成立 ，实例参考 附录E。当被检样品出现典型的扩增曲线且 Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒 核酸阳性；被检样品无 Ct 值，判为非洲猪瘟病毒 核酸阴性；对于 Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线 ，应重检，重检 仍出现 上述结果 的判为阳性 ，否则判为阴性 。 7 实验室生物安全要求 7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操 作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生 物安全管理要求 见GB 19489 。国家农业行政主管部门 另有规定的，按其规定执行。 7.2 使用过的 实验器材和液体废弃物应 先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品 等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 5—2018 4 附 录 A (规范性附录 ) 试剂的配制 A.1 DNA提取液1 PEG8000 晶体 20.74g，NaCL17.53g ，加去离子水定容到 100 mL。 A.2 DNA提取液2 1mol/L Tris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL ，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容 到100 mL。 即KCL 14.912g，