ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 3—2018 兽医检测用核酸标准物质研制技术规范 Technical specifications for Producing Nuclear Acid Reference Materials for Veterinary Detection 2018 - 10 - 24发布 2018 - 10 - 24实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 3—2018 1 前 言 本标准按 照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人： 王传彬、杨林、 原霖、宋晓晖、辛盛鹏、董浩、刘玉良、顾小雪、刘洋、韩焘、 陈亚娜。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 3—2018 2 兽医检测 用核酸标准物质研制技术规范 1 范围 本标准规定了兽医 检测用核酸标准物质 的制备、均匀性 及稳定性评估、不确定度评定、定值 及结果 表示、标签和使用说明书、包装、贮存和运输、生物安全 。 本标准适用于 利用细菌、病毒等 微生物或其核酸 制备兽医检测用核酸标准物质 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应 用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 JJF 1005 -2016 标准物质 通用术语和定义 JJF 1343 -2012 标准物质定值的通用原则及统计学原理 3 术语和定义 JJF1005-2016界定的下列术语和定义适用于本 文件。为了便于使用， 以下重复列出了 JJF 1005-2016 中的某些术语和定义。 3.1 标准物质 （又称标准样品） reference material 具有足够均匀和稳定的特定特性的物质，其特性适用于测量或标称特性检查中的预期用途。 ［JJF1005-2016 ，第3.1条］ 3.2 有证标准物质 certified reference material 附有由权威机构发布的文件， 提供使用有效程序获得的具有不确定度和溯源性的一个或多个特性值 的标准物质。 ［JJF1005-2016 ，第3.2条］ 3.3 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 3—2018 3 特性值 property value 与标准物质的物理、化学或生物特性有关的值。 ［JJF1005-2016 ，第4.1条］ 3.4 定值 characterization 作为研制（生产）程序的一部分，确定标准物质特性值的过程。 ［JJF1005-2016 ，第3.12条］ 3.5 均匀性 homogeneity 标准物质中特定部分的某个规定特性值的一致性。 ［JJF1005-2016 ，第3.14条］ 3.6 稳定性 stability 在特定的时间范围和贮存条件下，标准物质的 特性值保持在规定范围内的能力。 ［JJF1005-2016 ，第3.17条］ 3.7 不确定度 uncertainty 根据所用到的信息，表征 赋予被测量量值分散性的非负参数。 ［JJF1005-2016 ，第4.15条］ 4 兽医检测 用核酸标准物质制备 4.1 候选物选择 4.1.1 兽医检测 用核酸标准物质的原料应选择具有代表性的病毒、细菌或其他微生物， 或含有其全部 核酸或特定核酸片段 的质粒。所有原料 应获得全部 核苷酸序列。 4.1.2 制备标准物质的候选物不应含有干扰性杂质，应有足够的稳定性和高度的特异性，并有足够的 数量。特性值范围应适合该标准物质的用途。 4.2 标准物质 原料制备 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 3—2018 4 4.2.1 兽医检测 用核酸标准物质 应根据候选物的性质，选择合理的制备程序 和工艺，并防止污染及待 定特性量的量值变化。需加保护 剂等物质的，该类物质应对标准物质的活性、稳定性和试验操作过程无 影响。 4.2.2 兽医检测 用核酸标准物质 的分装精确度应在 ±1.0 %以内。需要干燥保存 的应在分装后立即进行 冻干和密封。冻干水分含量应不高于 3.0 %。 4.2.3 分装、冻干和 密封过程中，应保持各瓶间含量的一致性 和稳定性 。 5 均匀性评估 5.1 抽取单元数 按照JJF 1343 -2012 4.3.1的规定，若记总体 单元数为N，当N≤200时，抽取 单元数不少于 11个；当 200＜N≤500时，抽取 单元数不少于 15个；当500＜N≤1000时，抽取 单元数不少于 25个；当总体 单元数N ＞1000时，抽取样品数不少于 30个。对于均匀性好的样品，当 N≤500时，抽取 单元数不少于 10个；当N ＞500时，抽取 单元数不少于 15个。 一般情况下，每个抽取 单元应独立取样 ，重复测量次数不少于两次。 5.2 抽样方式 按照 JJF 1343 -2012 4.3.2的规定，抽样方法可以是随机抽样 或分层随机抽样。 5.3 检测方法 采用实时荧光定量 PCR或数字PCR的方法进行均匀性 评估。使用的方法不低于定值方法 的精密度和灵 敏度。 5.4 最小取样量 将均匀性 评估的取样量作为最小取样量。 5.5 均匀性评估的结果评价 按照JJF 1343-2012 4.3.5～4.3.7的规定， 对标准物质的 m个包装单元 重复检测n次，采用方差分析 方法对标准物 质进行均匀性 评估。 按式（ 1）和（ 2）计算组间差方 和与组内差方和： 2 11 ) ( xxn Qim ii   …………………………………………（ 1） 式中： 1Q —组间差方和 ； in —每i个单元重复测定的次数 ； 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 3—2018 5 —均匀性检验抽取的 单元数； ix —第i个单元内测定的平均值； x —m个单元测量结果的 总平均值 。 2 1 12 ) (  m in ji ijx x Q ……………………………… ………（ 2） 式中： 2Q —组内差方和 ； —均匀性检验抽取的 单元数； n —每一单元重复测定的次数 ； jxi —第i个单元内的第 j个测定值 ； ix —第i个单元内测定的平均值。 按式（ 3）和（ 4）计算组间自由度和组内自由度： 11mv ………………… ……………… ………………… （3） 式中： 1v —组间自由度 ； —均匀性检验抽取的 单元数。 mN v2 ………… ……………………… ……………… （4） 式中： 2v —组内自由度 ； N —均匀性检验的总次数； —均匀性检验抽取的 单元数。 按式（ 5）和（ 6）计算组间方差和组内方差： 11 2 1 vQs ……………………………………………（ 5） 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 3—2018 6 式中： 2 1 s —组间方差 ； 1Q —组间差方和 ； 1v —组间自由度 。 22 2 2 vQs …………… ………… ……………………（ 6） 式中： 2 2s —组内方差 ； 2Q —组内差方和 ； 2v —组内自由度 。 按式（ 7）计算统计量 F： 2 22 1 ssF ………… …………………………………… （ 7） 式中： 2 1s —组间方差 ； 2 2s —组内方差 。 根据自由度 ),(2 1vv 及给定的显著性水平 α，可由 JJF 1343 -2012附录 B表B.2 F表查得 F值。若 按公式算得的 F 值满足 FF ，则认为数据组间无明显差异 ，样品是均匀的 ；若 FF ，则怀疑 各组间有系统差异，即样品之间存在差异。 兽医检测用核酸标准物质应 达到均匀性评估的要求。 5.6 不均匀性引起的不确定度 瓶间均匀性标准偏 差 bbs可以按式（ 8）公式计算： nsssbb2 22 1 2 ………… ……………………………… （ 8） 在这种情况下， bbs 等同于瓶间不均匀性导致的不确定度分量 bbu，见式（ 9）。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 3—2018 7 bb bbs u ………………………………………………（ 9） 式中： bbs —瓶间标准偏差 ； bbu —标准物质的不均匀性引起的不确定度 ； n —组内测量 次数； 2 1s —组间方差 ； 2 2s —组内方差 。 6 稳定性评估 6.1 稳定性的类型 标准物质研制时，主要 应检测两种稳定性 (不稳定性 )： ——长期稳定性 是物质在特定保存条件下有效期内的