目摇摇次 前言 玉 ………………………………………………………………………………………………………… 1摇范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2摇规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3摇术语和定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4摇方案 2 ……………………………………………………………………………………………………… 5摇仪器设备 2 ………………………………………………………………………………………………… 6摇试剂和溶液配制 2 ………………………………………………………………………………………… 7检验程序 3 …………………………………………………………………………………………………… 8摇结果判定 4 ………………………………………………………………………………………………… 9摇结果报告 4 ………………………………………………………………………………………………… 10摇质量保证 4 ………………………………………………………………………………………………… 11摇废弃物处理 4 ……………………………………………………………………………………………… 附录A(资料性附录)金钱白花蛇快速PCR鉴定体系的建立 5 …………………………………………前摇摇言 本标准的全部技术内容为推荐性。 本标准是对《中华人民共和国药典》标准的补充。 本标准由中华中医药学会归口。 本标准起草单位:中国中医科学院中药资源中心、广东省食品药品检验所。 本标准主要起草人:袁媛、黄璐琦、李华、蒋超、杨志业、赵玉洋、何雅莉。 请注意本标准的某些内容有可能涉及专利,本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 玉T/CACM012—2016 金钱白花蛇快速PCR鉴定 1摇范围 本标准规定了使用快速PCR鉴定金钱白花蛇药材和饮片的通用方法和要求。 本标准适用于金钱白花蛇药材和饮片鉴定。 2摇规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版 本适用于本标准。 《中华人民共和国药典》(2015年版) GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》 GB/T23632《进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程》 GB/T27403《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》 3摇术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3郾1 送检样品testsample 按一定规则取自某一整体的一个或多个部分,并能反映该整体的相关信息,可以作为判断该整体 的基础。 3郾2 DNA提取DNAextraction 从样品提取出DNA的方法。 3郾3 DNA扩增DNAamplification 通过一定技术使一段特定的DNA片段拷贝数增加的过程,可通过聚合酶链式反应技术实现。 3郾4 聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR) 模板DNA先经高温变性为单链,两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退 火,在DNA聚合酶的作用下,以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸,然后不 断重复变性、退火和延伸这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段拷贝数呈几何倍数扩增。 其扩增产物可通过多种特异性和敏感性好的方法进行分析。 3郾5 阳性对照positivecontrol 一般使用对照药材代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用于证明鉴定过 程可获得目标核酸片段的操作。 3郾6 阴性对照negativecontrol 使用常见伪品药材代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程。 3郾7 空白对照blankcontrol 以水代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用以证明提取过程中没有核酸 1T/CACM012—2016 污染。 4摇方案 金钱白花蛇快速PCR鉴定应采用抽取有代表性的送检样品与对照药材比较的验证方式,即依据 金钱白花蛇特异性DNA序列进行鉴定。利用碱裂解法提取金钱白花蛇模板DNA,以提取的DNA为模 板进行PCR扩增,荧光检测或琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。 5摇仪器设备 5郾1摇仪器设备 所有制备样品使用的器具在使用前应灭菌处理。 5郾1郾1摇PCR仪 使用前应进行温度校准。 5郾1郾2摇手持式紫外灯 可检测365nm紫外波长。 5郾1郾3摇连续可调微量移液枪 至少应该包括0郾1~2郾5滋L、0郾5~10郾0滋L、10~100滋L、100~1000滋L规格,并包括配套一次性 吸头。 5郾1郾4摇保温设备 至少应包含4益与-20益温区。 6摇试剂和溶液配制 除另有规定外,实验试剂为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂;实验用水符合GB/T6682 的要求;所配制的试剂均应灭菌后保存,并在容器上注明试剂名称、浓度、配制时间、保存条件、失 效日期和配制者姓名;PCR试剂应小量分装保存以减少污染;材料及试剂的保存都应有防污染措施。 6郾1摇DNA提取缓冲液 含有0郾5mol/L氢氧化钠(NaOH)、1%聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)、1%聚乙二醇辛基苯基 醚(TritonX100)溶液:在800mL去离子水中溶解20郾0gNaOH,冷却至室温后加入10gPVP和 10mLTritonX100,溶解后加水定容至1L,分装后过滤除菌。 6郾2摇中和缓冲液 含有0郾1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)溶液,pH值为8郾0:在800mL去离子水中 溶解12郾1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8郾0,加水定容至 1L,分装后高压灭菌。 6郾3摇dNTP混合液 含有等量dATP、dCTP、dGTP、dTTP,使用时调整浓度至10mmol/L。 6郾4摇10伊PCR缓冲液 依据不同类型的Taq酶选择对应的10伊PCR缓冲液。 6郾5摇20%PVP溶液 在80mL去离子水中溶解20郾0gPVP-40,加水定容至100mL,分装后过滤除菌,冷却后-20益 保存。 6郾6摇10mg/mLBSA溶液 在80mL去离子水中溶解1郾0g牛血清白蛋白(BSA),加水定容至100mL,分装后过滤除菌,冷 却后-20益保存。 6郾7摇TaqDNA聚合酶(5U/滋L) 检测用TaqDNA聚合酶应无3爷寅5爷核酸外切酶活性,TaqDNA聚合酶在-20益下保存,使用 时置冰上操作。 2T/CACM012—2016 6郾8摇金钱白花蛇检测用引物对序列 JQBHS郾F:5'-GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT-3'; JQBHS郾R:5'-GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA-3'。 用灭菌ddH2O将上述引物溶解至10滋mol/L。 6郾9摇50伊TAE电泳缓冲液 在800mL去离子水中溶解242gTris,37郾2g乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA·2H2O,加入57郾1mL的 醋酸,充分混匀,加去离子水定容至1L,室温保存,使用时用去离子水50倍稀释。 6郾10摇6伊加样缓冲液 在80mL去离子水中溶解溴酚蓝250mg,二甲苯青250mg,蔗糖250mg,加水定容至100mL, 分装。 7检验程序 为防止交叉污染,收样、取样、粉碎、DNA提取、核酸扩增和产物检测应在不同操作间或在同 一操作间不同隔离区域进行,进入各区域应严格按照单一方向进行,即样品制备区寅核酸制备区寅扩 增区寅检测区。 7郾1摇取样 送检样品抽样方法参照2015年版《中华人民共和国药典》四部药材和饮片取样法(通则0211) 进行取样。送检样品应可分成2批,每批可分为同样的3份,总量不应少于20g。收样时应检查包装 的完整性,并在样品袋上贴上标签,填写采集数据表。对商品包装和送样说明进行拍照记录,照片随 样品一起备档。去除药材和饮片表面附着物,依次使用75%乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干。 7郾2摇粉碎 取送检样品置乳钵、匀浆机或球磨粉碎仪中充分研磨粉碎,必要时加适量液氮研磨。 7郾3摇DNA提取 称取经预处理的送检样品20mg置2郾0mL离心管中;加入200滋L提取缓冲液,充分混匀;加入 800滋L中和缓冲液,充分混匀;12000r/min离心1min或静置5min;转移500滋L上清液至一新的 1郾5mL离心管,加入500滋L中和缓冲液,充分混匀;12000r/min离心1min或静置5min;转移上清液 作为DNA模板待测或-20益保存备用。每个送检样品必须重复2次,每1次从送检样品提取核酸的 过程都必须设置1个提取空白对照。 注:使用碱裂解法提取的金钱白花蛇DNA可在4益下保存3天或-20益下保存7天,不宜长期保存。 7郾4摇核酸扩增 首次使用本方法时,应校对PCR仪温控准确性,并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的Taq 聚合酶的适用性。 7郾4郾1摇对照试验 PCR检测应重复2次,并设置阳性对照、阴性对照和空白对照。 7郾4郾2摇PCR反应体系 在200滋L的PCR管中进行,反应总体积为25滋L,反应体系包括10伊PCR缓冲液2郾5滋L、dNTP 混合液(10mmol/L)1滋L、鉴定引物(10滋mol/L)各0郾2滋L、TaqDNA聚合酶1滋L、模板DNA(10 ~50ng)1滋L,无菌双蒸水19郾1滋L。将反应液充分混匀。 7郾4郾3摇PCR反应参数 将