目摇摇次 前言 玉 ………………………………………………………………………………………………………… 1范围 1 ………………………………………………………………………………………………………… 2规范性引用文件 1 …………………………………………………………………………………………… 3术语、定义 1 ………………………………………………………………………………………………… 4方案选择要求 2 ……………………………………………………………………………………………… 5仪器设备 2 …………………………………………………………………………………………………… 6试剂、溶液配制 2 …………………………………………………………………………………………… 7检验程序 2 …………………………………………………………………………………………………… 8结果分析和表示 3 …………………………………………………………………………………………… 9结果报告 3 …………………………………………………………………………………………………… 10质量保证 4 ………………………………………………………………………………………………… 11废弃物处理 4 ………………………………………………………………………………………………前摇摇言 本标准为中药分子鉴定通则系列标准之一,其目前包括以下标准: T/CACM010郾1—2016《中药分子鉴定通则第1部分:中药材与中药饮片》 T/CACM010郾2—2016《中药分子鉴定通则第2部分:中药提取物与中成药》 T/CACM010郾3—2016《中药分子鉴定通则第3部分:中药材种子种苗》 本标准的全部技术内容为推荐性。 本标准在遵从《中华人民共和国药典》的基础上,提出了《中药分子鉴定标准通则》。 本标准由中华中医药学会归口。 本标准起草单位:中国中医科学院中药资源中心、中国食品药品检定研究院、国药种业有限 公司。 本标准主要起草人:黄璐琦、袁媛、马双成、蒋超、魏锋、张文娟、郑健、赵玉洋、周骏辉、何 雅莉、王继永。 玉T/CACM010郾3—2016 中药分子鉴定通则 第3部分:中药材种子种苗 1摇范围 本标准规定了使用分子生物学手段鉴定中药材种子种苗的通用方法和要求。 本标准适用于中药材种子种苗鉴定。 2摇规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 《中华人民共和国药典》 GB/T6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》 GB/T23632—2009《进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程》 GB/T27403—2008《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》 GB/T3543郾1—1995《农作物种子检验规程总则》 GB/T3543郾5—1995《农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定》 3摇术语、定义 下列术语和定义适用于本标准。 3郾1摇 DNA提取DNAextraction 从样品中提取出DNA的方法。 3郾2摇 DNA扩增DNAamplification 通过一定技术使一段特定的DNA片段拷贝数增加的过程,可通过聚合酶链式反应技术或其他 DNA扩增技术实现。 3郾3摇 聚合酶链式反应polymerasechainreaction 简称PCR技术。模板DNA先经高温变性为单链,两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一 段互补序列发生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物 得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段拷贝数 呈几何倍数增长。其扩增产物可通过多种特异性和敏感性好的方法进行检测。 3郾4摇 阳性对照positivecontrol 一般使用对照样品代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用于证明鉴定过 程可获得目标核酸片段的操作。 3郾5摇 阴性对照negativecontrol 使用常见混淆样品代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程。 3郾6摇 空白对照blankcontrol 以水代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用以证明提取过程中没有核酸 污染。 1T/CACM010郾3—2016 3郾7摇 对照样品standardsample 包括对照药材和种子种苗对照样品。种子种苗对照样品指由中药材种子种苗标准起草单位提交, 经全国中药材种子(种苗)标准化技术委员会认定并保存,与品种名称相符的种子种苗样品。 3郾8摇 种子种苗品种真实性seedandseedlingvarietygenuineness 送检样品与该品种文件标注的对照样品相符。 4摇方案选择要求 中药材种子种苗分子鉴定应采用抽取有代表性的送检样品与对照样品比较的验证方式,检测结果 以规定数目引物的DNA位点差异数目表示。使用SSR或SNP标记法进行检测,并根据检测目的不同 要求,选择适宜的检测方案。每次鉴定实验均应包含阳性对照、阴性对照和空白对照。 5摇仪器设备 所有制备样品使用的器具在使用前应灭菌处理。根据方案,写出标准中需要说明的仪器设备。 6摇试剂、溶液配制 试剂配制所用水应符合GB/T6682—2008规定的一级水要求。试剂应为不含DNA和DNase的分 析纯或生化试剂。试剂的保存应有防污染措施。试剂配制操作应在单独的制备区进行。所配制的溶液 均须高压灭菌保存,不宜高压灭菌的试剂应使用超滤设备(孔径0郾22滋m)除菌。应记述鉴别引物的 名称和序列、合成引物质量要求、纯化方式等。无特殊说明时,所有的酶应在-20益保存,使用时应 在冰上操作。 7摇检验程序 7郾1摇检查注意事项 根据检测目的不同要求,选择适宜的DNA提取、扩增和检测程序。为防止交叉污染,收样、取 样、粉碎、DNA提取、核酸扩增和产物检测应在不同操作间或在同一操作间不同隔离区域进行,进 入各区域应严格按照单一方向进行,即样品制备区寅核酸制备区寅扩增区寅检测区。 7郾2摇取样 取样应在样品制备区进行。送检样品、试样的抽取、分取应有代表性。应根据送检样品的不同要 求,确定样品的数量或重量。在生产基地取样,送检样品可以为组织或器官;在加工或销售地点取 样,送检样品为种子或种苗。 7郾3摇粉碎 粉碎应在样品制备区进行。取送检样品置乳钵、组织匀浆机或球磨粉碎仪中充分研磨,必要时加 适量液氮研磨。进行样品前处理时应有预防交叉污染的措施,以避免送检样品交叉污染而导致假阳性 结果的出现。 7郾4摇DNA提取 DNA提取应在核酸制备区进行。应根据送检样品特性选择合适的DNA提取方法或用等效DNA 提取试剂盒进行DNA提取,所提取的DNA应符合扩增的要求,模板DNA必要时可进行适当的稀释 或浓缩。 7郾5摇核酸扩增 扩增应在扩增区进行。核酸扩增反应体系总体积可依据中药材种子种苗种类及其所使用方法确 定。应根据核酸扩增仪型号、酶、引物等选择适宜的反应程序。扩增产物于4益保存。应记述鉴别引 物的预期扩增片段长度范围、条带数目等信息。 7郾6摇扩增产物检测 扩增产物检测应在检测区进行。根据检测方案,选择合适的扩增产物检测方法,包括琼脂糖凝胶 2T/CACM010郾3—2016 电泳、聚丙烯胺凝胶电泳、核酸序列测定、荧光检测等。 8摇结果分析和表示 8郾1摇物种鉴定 8郾1郾1摇特异性PCR 8郾1郾1郾1摇凝胶电泳法 在阴性对照、阳性对照和空白对照结果均符合规定的情况下,若送检样品出现预期数目和大小的 特征条带,则判定测试结果为阳性;若送检样品未出现预期数目和大小的特征条带,则判定为阴性。 8郾1郾1郾2摇荧光检测法 在阴性对照、阳性对照和空白对照结果均符合规定的情况下,若送检样品与阳性对照一致,则判 定测试结果为阳性,否则为阴性。 8郾1郾2摇核酸序列测定和分析 扩增产物经适当纯化、浓缩后使用DNA测序仪双向测序,将拼接获得序列与阳性对照序列进行 比对,依据二者序列相似度和谱系关系原则判定。 8郾1郾3摇其他方法 应根据选择方法的技术原理要求和品种实际需求建立结果分析和表示方法。 8郾2摇种质、品系或品种鉴定 检验结果采用比较送检样品和标准样品位点的差异数目表示。统计位点差异记录的结果,计算比 较位点数、差异位点数及差异位点。位点差异记录分为下列三种情形: 位点存在差异的或完全相同的,记录为有差异或无差异; 位点数据缺失的,记录为缺失; 位点显示无法判定的,记录为无法判定。 9摇结果报告 9郾1摇一般要求 对物种真实性定性检测结果应表示为阳性“+冶或阴性“-冶;定量检测结果应符合具体品种分 子鉴别标准。对种质、品系或品种的检验结果可按送检样品与标准样品间差异位点数判断,当样品间 差异位点数逸2,则判定为“不同冶;当样品间差异位点数=1,判定为“近似冶;当样品间差异位点 数=0,判定为“极近似或相同冶。 9郾2摇鉴定报告 样品经检测后,根据具体操作程序和结果做好详细的实验记录,出具检测报告。检测报告至少包 含以下内容: 送检样品的名称、状态和明确的标识; 检测依据; 取样方法与日期; 储存条件; 检测开始和结束日期; 检测负责人和实验人员; 阳性对照、阴性对照、送检样品; 特定方法取得的结果,结果使用的单位及计算方法; 检测结论; 检测过程观察到的特别情况; 其它需要报告的内容。 3T/CACM010郾3—2016 10摇质量保证 检测结果应来自两份送检样品。当一份送检样品的结果为阳性,另一份为阴性时,需重新测试。 可以适当增加核酸扩增