ICS 11.220 CCS B 41 34 安 徽 省 地 方 标 准 DB34/T 4044—2021 布鲁氏杆菌病抗体快速检测方法 疫层析法 荧光免 The Rapid detection methods for antibodies to brucella The hypersensitive fluorescence immunochromatographic assay 2021-09-30 发布 2021-10-30 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 4044—2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由阜阳市动物疫病预防与控制中心提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：阜阳市动物疫病预防与控制中心、安徽省荷森生物技术有限公司、成都微瑞生物 科技有限公司、阜南县动物疫病预防与控制中心、颍上县动物疫病预防与控制中心、颍东区枣庄镇农业 综合服务站、庐江县动物疫病预防与控制中心、安徽省质量认证服务中心。 本文件主要起草人：高树朋、訾振义、刘雪梅、蔡强、李超、吴雪荷、张明飞、周铜铜、张贺森、 高永士、杨琳、李晓辉、陈菁菁。 I DB34/T 4044—2021 布鲁氏杆菌病抗体快速检测方法 荧光免疫层析法 1 范围 本文件规定了布鲁氏杆菌病抗体快速检测 荧光免疫层析法的原理、仪器和试剂、样品采集与处理、 操作方法、结果分析、生物安全及防污染措施。 本文件适用于猪、牛、羊的布鲁氏杆菌病抗体水平的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 荧光免疫层析法（The Hypersensitive Fluorescence Immunochromatographic Assay，HFIA）快 速检测布鲁氏杆菌病抗体，是采用镧系铕（Eu3+）元素荧光纳米微球作荧光示踪物，分别标记布鲁氏杆 菌 LPS 抗原和鸡 IgY,并埋置在标记垫内。硝酸纤维素膜上检测线（T）包被布鲁氏杆菌特异性单抗， 参考线（C）包被兔抗鸡 IgY 的 IgG。血清样品抗体与埋置在标记垫内标记的布鲁氏杆菌 LPS 抗原荧 光纳米微球反应形成复合物，从而抑制与包被在硝酸纤维素膜上检测线（T）布鲁氏杆菌单抗反应，使 检测线（T）荧光信号较弱。其余物质继续向前层析，在 C 线处包被的“荧光标记鸡 IgY +兔抗鸡 IgY” 结合形成免疫结合物。用高敏荧光分析仪读取检测卡上的荧光信号，根据标准曲线计算得出布鲁氏杆菌 病抗体效价。 5 仪器与试剂 5.1 5.1.1 5.1.2 2 仪器 高敏荧光分析仪：激发波长为(400±20)nm，检测波长为(615±10)nm。 单道可调移液器：10～100μL, 100～1000μL。 DB34/T 4044—2021 5.1.3 5.1.4 5.2 离心机：转速 3000～15000r/min。 冰箱：2℃～8℃，-20℃。 试剂 5.2.1 实验用水 符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 5.2.2 样品稀释液 5.2.2.1 成分：十二水磷酸氢二钠 2.68 g，二水磷酸二氢钠 0.44 g，叠氮化钠 1 g，硫酸葡聚糖 （MW:40000）5 g，硫酸葡聚糖（MW:20000）10 g，双蒸水 1000 mL。 5.2.2.2 制法：将上述成分溶解混匀后分装，保存于 4℃备用。 5.2.2.3 所用试剂均为分析纯。 5.2.3 布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡 见附录A。 6 6.1 样品采集与处理 样品采集 按照 NY/T 541 的规定，采集待检猪、牛、羊血液样品 3～5 mL/份。 6.2 样品处理 血液样品用离心机 3000 r/min 离心 3 min，血清量不少于 500μL。 6.3 样品贮存 血清样品在 2℃～8℃可保存 24 h，如需长期保存应置 -20℃以下。 7 7.1 操作方法 准备 将布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡和待检血清样品回温至 25℃左右。 7.2 稀释 用样品稀释液将 50 µL 待检血清样品按 1:10 稀释。 7.3 加样 将布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡水平放置，用移液器吸取已稀释好的待检样品 80 µL 垂直滴加于加样孔内。 7.4 检测 3 DB34/T 4044—2021 常温下，避光层析 15 min 后用高敏荧光分析仪检测。 8 结果计算 8.1 依据检测需求信息选择相应批次的标准曲线、高敏荧光分析仪检测的检测线（T）和质控线（C） 的荧光信号，自动计算获得被检样本中布鲁氏杆菌病抗体的效价。 8.2 标准曲线示意图参见附录 B 图 B.1。 9 判定标准 如下： ——效价≥50 为阳性，代表保护抗体有保护或被布鲁氏杆菌感染； ——效价≤25 以下为阴性，代表保护抗体不保护或尚未被布鲁氏杆菌感染； ——效价 25～50 之间为可疑，需 30 天后采血重检，如果仍为可疑，判为阳性。 10 生物安全及防污染措施 10.1 生物安全措施 按照 GB 19489 中的有关规定执行。 10.2 防污染措施 应符合 GB/T 27401 的规定。 4 DB34/T 4044—2021 附 录 A （规范性） 布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡制备 A.1 试剂条制作 检测线（T）包被布鲁氏杆菌特异单抗。 质控线（C）包被兔抗鸡 IgY 的 IgG。 用划膜机将配制的检测线工作液和质控线工作液划至硝酸纤维素（NC）膜上。 3+ 采用镧系铕（Eu ）元素纳米荧光微球作荧光示踪物标记布鲁氏杆菌 LPS 抗原和鸡 IgY。 用喷膜机分别将两种标记荧光微球的工作液喷至玻璃纤维素膜上（标记垫）。 A.2 试剂条组装 聚氯乙烯（PVC）底板上从左到右依次粘贴样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫的右 端搭在标记垫的左端上，标记垫的右端搭在硝酸纤维素膜的左端上，吸水纸的左端搭在硝酸纤维素膜的 右端上。 将组装好的 PVC 板切成 5 mm 宽试纸条。 A.3 试剂卡装配 将切割 5 mm 宽的试纸条放于检测卡的下盖内，摆平摊后将检测卡的上盖扣紧。即完成布鲁氏杆菌 抗体荧光检测试剂卡（简称试剂卡），见图A.1。 图A.1 布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡装配示意图 5 DB34/T 4044—2021 附 录 B （资料性） 布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法标准曲线 B.1 布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法标准曲线 见图B.1。 图中： x ——样品检测线的荧光值与对照线的荧光值之比（T/C）的对数； y ——样品抗体效价的对数； 2 R ——相关系数。 图B.1 布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法标准曲线示意图 6