ICS 65.020.99 CCS B 05 35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 2021—2021 巨菌草固氮菌肥料生产技术规范 Technical code for production of Pennisetum giganteum z.x. Lin nitrogen fixing bacterial fertilizer 2021 - 11 - 23 发布 2022 - 02 - 23 实施 福建省市场监督管理局 发 布 DB35/T 2021—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由福建农林大学提出。 本文件由福建省农业农村厅归口。 本文件起草单位：国家菌草工程技术研究中心、福建省标准化研究院、龙岩学院、儋州牧春绿色生 态农业开发有限公司、陕西鄜州神鹿生态产业有限公司。 本文件主要起草人：林占熺、林孟朝、鲁国东、梁静、林冬梅、陈光华、林标声、程晓明、李晶、 林兴生、林辉、叶文雨、罗海凌、余世葵、张双双、张丽丽、罗宗志、王可楠、林才伟。 I DB35/T 2021—2021 巨菌草固氮菌肥料生产技术规范 1 范围 本文件规定了巨菌草固氮菌肥料的生产车间、菌种、原辅料、生产流程和生产技术要点。 本文件适用于巨菌草固氮菌肥料的生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 3838—2002 地表水环境质量标准 GB/T 35885 红糖 HG/T 2843 化肥产品化学分析常用标准滴定溶液、标准溶液、试剂溶液和指示剂溶液 NY 411 固氮菌肥料 NY/T 1113 微生物肥料术语 3 术语和定义 NY 411、NY/T 1113 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 巨菌草 Pennisetum giganteum z.x.Lin 隶属于禾本科、狼尾草属，具有适应性广、抗逆性强、产量高、粗蛋白和糖分含量高的优良菌草品 种。 3.2 巨菌草固氮菌肥料 JUNCAO nitrogen fixing bacterial fertilizer 将从巨菌草中分离出来的固氮菌制备成菌液，与菌草、菌草菌糟等物质混合发酵而成的固氮菌肥料。 4 生产车间 4.1 发酵车间与吸附等后处理车间距离适当，相对隔离，有密闭且可以灭菌的传输通道。 4.2 粉碎车间与菌种车间、发酵车间相对隔离。 4.3 发酵菌种的储藏间、无菌操作间与生产车间相对隔离。 4.4 发酵生产关键性车间采用双路供电或备用一套发电机。 5 菌种 采用从巨菌草中分离得到的内生固氮菌：变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）和玉米联合固 氮菌（Kosakonia radicincitans）。 1 DB35/T 2021—2021 6 原辅料 6.1 巨菌草 采用拔节期到生长一年内的巨菌草，收集其茎、叶；经低温烘干和粉碎后，过80～100目筛，储存、 待用。 6.2 菌草菌糟 收集无杂菌、无霉变的巨菌草栽培食药用菌菌糟，经低温烘干和粉碎后，过80～100目筛，收集、 储存、待用。 6.3 水 固氮菌扩培、发酵用水应符合GB 3838—2002中Ⅲ类水质要求，冷却水及其他用水应符合GB 3838 —2002中Ⅳ类水质要求。 6.4 红糖 应符合GB/T 35885的规定。 6.5 标准滴定溶液、试剂溶液和指示剂溶液 应符合HG/T 2843的规定。 7 生产流程 巨菌草固氮菌肥料的通用生产环节包括：菌株活化、摇瓶培养、种子罐发酵培养、扩大生产、菌液 制备、营养液制备、物料粉碎、混合、装袋发酵等，详见图1。 2 DB35/T 2021—2021 菌株活化 摇瓶培养 种子罐发酵培养 扩大生产 菌液制备 物料粉碎 混合 营养液 制备 装袋发酵 成品 图1 巨菌草固氮菌肥料生产流程 8 生产技术要点 8.1 菌株活化 从菌种保存库中，取出菌株，分别接种到相应的固体平板培养基上，并置于37 ℃恒温条件下培养 48 h～72 h。菌株活化所需培养基成分按照附录A中A.1的规定。 8.2 摇瓶培养 取500 mL～1 000 mL液体培养基装入摇瓶中，接入活化后的菌株，置于37 ℃恒温条件下振荡培 养48 h～72 h后获得的菌液即为种子。摇瓶培养所需培养基成分按照附录A中A.2的规定。 8.3 种子罐发酵培养 将摇瓶培养菌液接种入装有液体培养基的种子罐中，置于37 ℃恒温条件下培养36 h～72 h。种子 罐发酵培养基成分按照附录A中A.3的规定。 3 DB35/T 2021—2021 8.4 扩大生产 将种子罐中的菌种按5%比例接种至菌液发酵罐中，置于37 ℃恒温条件下搅拌培养48 h～96 h，进 行扩大生产。 8.5 菌液制备 将扩大生产后的变栖克雷伯氏菌、玉米联合固氮菌按1:1比例配制成菌液。菌液中固氮菌有效活菌 8 数为(2.6～4.6)×10 CFU/mL。 8.6 营养液制备 取红糖30 kg～50 kg、过磷酸钙10 kg～20 kg、硫酸镁0.5 kg～1.5 kg，加水定容至1 000 kg，制 成营养液，待用。 8.7 混合 先将巨菌草、菌草菌糟等混合均匀，再将菌液、营养液等加入培养基中搅拌均匀，混合的均匀度变 异系数（CV）应不大于7%。各种成分配比要求见表1。 表1 物料各种成分配比（按每 1 000 kg 计） 项目 要求 巨菌草草粉 650～750 kg 菌草菌糟 250～350 kg 菌液 150～200 L 营养液 100～150 L 水分 30～35 % pH 值 6.5～7.5 8.8 装袋发酵 8.8.1 应选择单向透气、带呼吸阀的聚乙烯（PE）塑料袋作为菌肥发酵袋，要求见表 2。 表2 项目 厚度 mm 透气孔径 mm 透氧量 3 cm /（m2·d·Pa） 4 发酵袋要求 要求 1～3 8～10 2.10～4.35 DB35/T 2021—2021 表2 发酵袋要求（续） 项目 排气压力 mm H2O 袋装容量 kg 要求 574～712 1～20 8.8.2 采用堆积发酵，发酵袋高度不超过 5 层，温度控制在 25 ℃～32 ℃之间，时间 5 d～10 d。待 发酵袋中物料颜色变深褐色，有一定的酸香味，无异臭味，即为成品。 5 DB35/T 2021—2021 A A A 附 录 A （规范性） 不同阶段菌种培养基配比 A.1 活化培养基 菌株活化培养基成分见表A.1。 表A.1 菌株活化培养基成分 项目 要求 甘露醇 10 g/L KH2PO4 0.2 g/L MgSO4·7H2O 0.2 g/L NaCl 0.2 g/L CaSO4·2H2O 0.1 g/L CaCO3 5.0 g/L pH 7.0～7.2 固体平板添加琼脂 20 g/L A.2 摇瓶培养基 摇瓶培养基成分见表 A.2。 表A.2 6 摇瓶培养基成分 项目 要求 甘露醇 20 g/L 酵母膏 1.0 g/L KH2PO4 1.5 g/L MgSO4·7H2O 0.2 g/L NaCl 0.1 g/L CaCl2 0.2 g/L FeCl3 0.4 g/L 钼酸铵 0.4 g/L pH 7.0～7.2 DB35/T 2021—2021 A.3 种子罐发酵培养基 种子罐发酵培养基见表 A.3。 表A.3 种子罐与发酵罐培养基成分 项目 种子罐发酵培养基成分 发酵罐培养基成分（按每吨计算） 糖蜜 20 g/L 20 kg 酵母膏 1.0 g/L 1.0 kg KH2PO4 1.6 g/L 1.6 kg MgSO4·7H2O 0.1 g/L 0.1 kg NaCl 0.05 g/L 0.05 kg CaCl2 0.05 g/L 0.05 kg pH 7.0～7.2 7.0～7.2 7