ICS 65.020.20 B 16 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 2180—2020 甘蔗黄叶病毒检测技术规程 Technical criterion for detection of sugarcane yellow leaf virus 2020 - 10 - 29 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2020 - 11 - 30 实施 发 布 — DB45/T 2180 2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。 本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。 本文件主要起草人员：魏春燕、覃振强、韦金菊、宋修鹏、张小秋、李德伟。 I — DB45/T 2180 2020 甘蔗黄叶病毒检测技术规程 1 范围 本文件规定了甘蔗黄叶病毒检测技术规程的样品采集与存放，组织免疫印迹法检测和一步法 RT-PCR 检测的原理、仪器与设备、试剂、操作步骤和检测结果的判定。 本文件适用于甘蔗黄叶病毒的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 +1 叶 top visible dewlap leaf 甘蔗植株最高可见肥厚带叶。 4 样品的采集与存放 4.1 采样工具 砍刀、剪刀、镊子等采样工具应经121 ℃±2 ℃、1.1×10 Pa高压灭菌15 min或经160 ℃干烤2 h。 5 4.2 采样方法 4.2.1 4.2.2 4.2.3 采样前和采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。 甘蔗植株采样：取甘蔗植株的+1 叶，剪掉叶尾，从叶基部开始保留 15 cm 长，编号保存备用。 甘蔗蔗种采样：取中部种茎，编号保存备用。 4.3 运送和存放 用于组织免疫印迹检测的样品采集后，用保温壶或保温桶加冰密封，在 2 ℃～8 ℃条件下进行 运送；运到实验室后应在 4 ℃条件下保存，存放应不超过 7 d。 4.3.2 用于一步法 RT-PCR 检测的样品采集后，用保温壶或保温桶加冰密封，在 2 ℃～8 ℃条件下进行 运送；运到实验室后在 4 ℃条件下保存应不超过 24 h，若需长期保存应放置-80 ℃冰箱且避免反复冻融。 4.3.1 1 — DB45/T 2180 2020 5 组织免疫印迹法检测 5.1 原理 将待测的样品印迹在固相载体硝酸纤维素膜上，用病毒的特异性抗体与吸附在固相载体上的病毒进 行特异性反应，再与碱式磷酸酶标记的第二抗体进行反应，最后用碱式磷酸酶的反应底物硝基酚磷酸片 进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。 5.2 仪器与设备 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 圆周式摇床：可调振荡速度 50 rpm～300 rpm。 普通光学显微镜：放大倍数范围 40 X～1 600 X。 电子天平：感量 0.1 g。 硝酸纤维膜、酒精灯、手术刀、载玻片、培养皿。 5.3 试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂；实验室用水符合 GB/T 6682 的二级水指标， 其中涉及 PCR 的用水应符合一级水指标；所有试剂均用灭菌的容器分装，配制好的溶液均在 4 ℃条件下 保存。 5.3.2 甘蔗黄叶病毒单克隆抗体。 5.3.3 碱性磷酸酯酶标二抗。 5.3.4 硝基酚磷酸片（BCIP/NBT）。 5.3.5 TBS-T 缓冲液（pH 7.5）：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）15.7 g，氯化钠（NaCl）8.7 g， 吐温-20（Tween-20）5 mL,用蒸馏水溶解并定容至 1 000 mL，pH 调到 7.5 后进行高温灭菌，冷却后保存 备用。 5.3.6 2％脱脂奶粉的 TBS-T 封闭液：称取 2 g 脱脂奶粉用 100 mL TBS-T 缓冲液配制成 2％脱脂奶粉的 TBS-T 封闭液，现配现用。 5.3.7 1％脱脂奶粉的 TBS-T 缓冲液：称取 1 g 脱脂奶粉用 50 mL TBS-T 缓冲液配制成 2％脱脂奶粉的 TBS-T 封闭液，现配现用。 5.3.8 标准样品： ——阳性对照：用已知含甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照； ——阴性对照：用已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照。 5.3.1 5.4 操作步骤 5.4.1 样品制备 从4 ℃冰箱中取出材料，用75％酒精进行叶片表面消毒，选取叶中脉，用经火焰消毒的解剖刀切叶 中脉并把新鲜切口垂直印在硝酸纤维膜上，保持5 s～6 s至硝酸纤维膜出现清晰完整的印迹，每个样品 3次重复印迹，印好的膜在室温下自然风干10 min～15 min后置于4 ℃冰箱保存备用。 5.4.2 操作流程 5.4.2.1 封闭 将印好的硝酸纤维膜置于盛有2％脱脂奶粉的TBS-T封闭液的培养皿中，封闭液的用量以覆盖硝酸纤 维膜为宜，置培养皿于转速为50 rpm的水平摇床，室温下孵育40 min～60 min。 2 — DB45/T 2180 2020 5.4.2.2 第一次洗涤 用TBS-T缓冲液洗膜3次，每次5 min，该过程在50 rpm的水平摇床上进行，保证膜可以完全洗脱干净。 5.4.2.3 第一次孵育 后的 有1％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液的培养皿中，同时在缓冲液中加入特异性抗体 1 000），在室温下孵育3 h或4 ℃静置过夜，室温孵育时在转速为50 rpm的水平摇床 将清洗 膜转入含 抗体稀释比例为 :7 上进行 （ 。 5.4.2.4 第二次洗涤 5. .2.2。 同 4 5.4.2.5 第二次孵育 后的 标 的 （ 。 有1 的TBS-T缓冲液的培养皿中，同时在缓冲液中加入含有碱式磷酸 1 2 000），在室温下孵育3 h，孵育时在转速为50 rpm的水平摇床上进 将清洗 膜转入含 ％脱脂奶粉 酶 记 二抗 抗体稀释比例为 : 行 5.4.2.6 第三次洗涤 5. .2.2。 同 4 5.4.2.7 显色和终止 后的 （ ， 基 于10 m 水）中，在5 min～10 min内观察，待 应。 L蒸馏 将清洗 膜转入显色液 每片硝 酚磷酸片溶 阳 显示清晰 紫蓝色时 将膜转入蒸馏 使之终止反 性对照 的 水中 5.5 检测结果的判定 5.5.1 判定依据 检测过程中分别设定阳性对照和阴性对照。用已知含有甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照，用已知不 含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照，判定依据如下： ——阴性对照：样品印迹在膜上未显示有任何紫蓝色； ——阳性对照：样品印迹在膜上显示有清晰的蓝紫色。 5.5.2 阴性 样品印迹在膜上未显示有任何紫蓝色，表示样品中不含甘蔗黄叶病毒。 5.5.3 阳性 样品印迹在膜上显示有清晰的蓝紫色，表示样品中含甘蔗黄叶病毒。 6 一步法 RT-PCR 检测 3 — DB45/T 2180 2020 6.1 原理 经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两 步法的形式进行。一步法RT-PCR中，反转录和PCR在同时为反转录和PCR的优化条件下，在同一支管中顺 次进行。 6.2 仪器与设备 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 6.2.7 6.2.8 6.2.9 普通 PCR 仪。 电子天平：感量 0.01 g。 高速台式冰冻离心机：最大离心力 15 000 g。 组织研磨仪。 水平电泳系统。 凝胶成像系统。 微量移液器：0.1 μL～2.5 μL，0.5 μL～10 μL，10 μL～100 μL，10 μL～200 μL，100 μL～1 000 μL。 无 RNA 酶的离心管、PCR 反应管、硝酸纤维膜、手术刀、载玻片、酒精灯。 冰箱：2 ℃～4 ℃，-20 ℃，-80 ℃。 6.3 试剂 植物 RNA 提取试剂盒。 一步法 RT-PCR 扩增试剂盒。 DNA 分子量标准物（100 bp～2 000 bp）。 DNA 凝胶加样缓冲液（6×DNA Loading Buffer）。 检测引物: ——上游引物 SCYLVf1：5’-GACAGACTCGGCCAGTGGTCGTG-3’； ——下游引物 SCYLVr1：5’-GTAAGCCATTGTTGAACGCTGCG-3’； ——扩增片段大小为 219 bp。 6.3.6 50×TAE 缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷（Tris）242.2 g，先用 300 mL 蒸馏水加热搅拌溶解后， 加 100 mL 500 mM/L 乙二胺四乙酸（EDTA）的水溶液（pH 8.0），用冰乙酸调 pH 至 8.0，用蒸馏水定容 到 1 000 mL。 6.3.7 1×TAE 缓冲液:取 50×TAE 缓冲液储液直接用蒸馏水进行 50 倍稀释即得到 1×TAE 缓冲液，现 配现用。 6.3.8 标准样品:同 5.3.7。 6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.3.4 6.3.5 6.4 操作步骤 6.4.1 总 RNA 的提取。 取与组织研磨仪配套使用且内含滚珠的 2 mL 无 RNA 酶离心管，并对每个管进行编号。 取出冰箱中存放的样品材料剪碎混匀后称取 1 g 样品（蔗茎样品要去除表皮）转至离心管， 并加入 0.9 mL 提取试剂盒中配备的 RNA 提取液。 6.4.1.3 将离心管置于组织研磨仪上震荡粉碎 2 min，取出离心管并置于 4 ℃、12 000 g 离心 10 min。 6.4.1.4 吸取上清液至另一不含滚珠的新 2 mL 无 RNA 酶离心管，并按照 RNA 提取试剂盒推荐的操作方 法完成 RNA 的提取，提取完成的 RNA 置于冰上保存备用。提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增；若 需长期保存，应放置-80 ℃冰箱。 6.4.1.1 6.4.1.2 4 — DB45/T 2180 2020 6.4.2 反转录及 PCR 反应 以样品、阴性和阳性对照总 RNA 为模板，并以超纯水为空白对照模板；选用一步法 RT-PCR 试剂盒在同一 PCR 反应管内进行反转录和 PCR 扩增，具体步骤按照试剂盒推荐的操作方法进行。 6.4.2.2