ICS 65.020.01 B 16 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 2031—2019 甘蔗白叶病植原体巢式 PCR 检测技术规程 Detecting technique regulations for phytoplasma of Sugarcane White Leaf based on Nested PCR 2019 - 12 - 05 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2019 - 12 - 30 实施 发 布 — DB45/T 2031 2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。 本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。 本标准主要起草人员：韦金菊、宋修鹏、刘昔辉、覃振强、张小秋、李杨瑞、张荣华、桂意云、魏 春燕、刘丽敏、吴建明、颜梅新、刘璐。 I — DB45/T 2031 2019 甘蔗白叶病植原体巢式 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗白叶病植原体（Sugarcane White Leaf Phytoplasma）巢式PCR检测的原理、试 剂、主要仪器与设备、样品的采集保存与运输、检测方法和结果描述及判定。 本标准适用于甘蔗白叶病病原菌植原体引起的病害及病原物的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 28067 甘蔗黄叶病病毒实时荧光RT-PCR检测方法 NY/T 2743 甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程 实时荧光定量 PCR 法 3 原理 巢式PCR( Nested Polymerase Chain Reaction) 是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对（而 非一对）PCR引物扩增完整的片段。利用植原体16SrRNA基因序列通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2，作为 巢式PCR的外侧和内侧特异引物对，可用于甘蔗白叶病植原体的快速检测。巢式PCR可增加PCR检测的灵 敏度和反应特异性。 4 试剂 所使用试剂均为分析纯，实验室用水符合 GB/T 6682—2008 的二级水指标，其中涉及 PCR 的用水 应符合一级水指标。 4.2 液氮。 4.3 植物基因组 DNA 提取试剂盒。 4.4 Gel Red 核酸染料。 4.5 2×EasyTaq PCR 反应预混液。浓度为 10 mmol/L，其中含有 0.05 U/μL Taq DNA Polymerase、0.4 Mm dNTP Mixture、4 mMMg 、2×PCR Buffer。 4.6 1×TE 缓冲液：市售产品。 4.7 1 500 bp DNA 分子质量标准物。 4.8 琼脂糖，电泳级。 4.9 内外检测引物序列： a) 外引物对： 1) P1：5‘- AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3’； 2) P7：5‘- CGTCCTTCATCGGCTCTT-3’。 4.1 2+ 1 — b) 内引物对： 1) R16F2n：5‘- GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’； 2) R16R2：5‘- TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’。 4.10 标样：阳性对照为已确定感染甘蔗白叶病植原体的样品基因组 DNA；阴性对照为确定未感染甘蔗 白叶病植原体的样品基因组 DNA。 DB45/T 2031 2019 5 主要仪器与设备 PCR 扩增仪。 。 白分析仪 外分光光 。 式 速 ： 12 000 水 。 ：2 4 、-20 、-80 。 菌 。 。 ： 量 0.001 。 量 样器：0.1 2. 、0. 200 、 0 1 000 。 5.1 5.2 凝胶成像系统 5.3 核酸蛋 或紫 度计 5.4 台 高 冷冻离心机 离心力 g 以上 5.5 恒温 浴锅 5.6 冰箱 ℃～ ℃ ℃ ℃ 5.7 高压灭 锅 5.8 鼓风干燥箱 5.9 电子天平 感 g 5.10 微 加 μL～ 5 μL 5 μL～ μL 5 μL～ μL 。 10 μL、2 μL～20 μL、10 μL～100 μL、20 μL～ 6 样品的采集、保存及运输 6.1 样品采集 按GB/T 28067的要求执行。其中，叶片样品和蔗茎样品参照NY/T 2743。采集1.0 g～2.0 g叶片或蔗 茎放于样品袋中，备用。 6.2 样品保存和运输 采集的样品放置于2 ℃～8 ℃条件下保存时间≤48 h；长期保存，需放置在-80 ℃条件下，不可反复 。 运输时，可采用保温箱中加干冰或液氮密封后运送。 冻融 长途 7 检测方法 7.1 样品 DNA 提取 样品0.1 g，用液氮冷冻研磨至粉末状，按所选择的植物基因组DNA提取试剂盒推荐的操作方法进 提 样品DNA。 取 行 取 7.2 样品 DNA 质量检测 样品DNA提取后，用蛋白/核酸分析仪鉴定样品DNA质量，当A /A 扩增。 260 7.3 巢式 PCR 检测 7.3.1 第一轮 PCR 扩增 2 280 比值 为1.8～2.0时，适合于PCR — 按下列方法配制20 μL PCR 扩增反应体系：2×Easy Taq PCR 反应预混液8.0 μL，上游外引物P1（10 μmol/L）0.3 μL，下游外引物P7（10 μmol/L）0.3 μL，DNA 模板(25 ng/μL)3.0 μL，PCR水8.4 μL。 第一轮PCR扩增参数：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，25个 循环；72 ℃延伸10 min。空白对照用无菌一级水代替样品DNA模板。 DB45/T 2031 2019 7.3.2 第二轮 PCR 扩增 按下列方法配制20 μL PCR 扩增反应体系：2×Easy Taq PCR 反应预混液8.0 μL，上游内引物R16F2n （10 μmol/L）0.3 μL，下游内引物R16R2（10 μmol/L）0.3 μL，第一轮PCR产物（稀释30倍）取3.0 μL 作为模板DNA，PCR 用水8.4 μL。 第二轮PCR扩增参数： 95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。空白对照为无菌一级水。 7.4 扩增产物的电泳检测 称取适量琼脂糖加入 1×TAE 缓冲液中，加热至完全溶解，配制成 1.5％的琼脂糖溶液；稍适冷 却后倒板，室温下凝固成琼脂糖凝胶。 7.4.2 分别取 2 μL 6×上样缓冲液和 5 μL 的第二轮 PCR 扩增产物到新的 PCR 管，振荡混匀，2 000 g 离 心 5 s。 7.4.3 分别将 5 μL DNA 分子量标准物和第二轮 PCR 产物混合液依次加入琼脂糖凝胶的点样孔后进行电 泳，电泳使用的电压为 80 V，电泳时间为 30 min。 7.4.1 7.5 凝胶成像分析 将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像仪上，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带大小，将电 泳结果用拍照系统拍照形成图片文件存档。 8 结果描述及判定 8.1 质控标准 阳性对照出现一条大小为1 240 bp±5 bp条带，阴性对照和空白对照无条带时判定为实验有效。 8.2 结果判定 阳性：被检样品泳道出现一条大小为 1 240 bp±5 bp 条带时，判为阳性，必要时进行测序。 阴性：被检样品没有出现一条大小为 1 240 bp±5 bp 条带，经重复 2 次检测后仍未出现扩增条 带时，判为阴性。 8.2.1 8.2.2 3 中华人民共和国广西地方标准 甘蔗白叶病植原体巢式 PCR 检测 技术规程 DB45/T 2031―2019 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究