(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111338662.6 (22)申请日 2021.11.12 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114163526 A (43)申请公布日 2022.03.11 (73)专利权人 深圳市人民医院 地址 518000 广东省深圳市罗湖区翠竹街 道东门北路1017号大院 (72)发明人 徐承超　李志杰　王惠芳　王继刚　 卓晓凤　付春进　袁吉民　 (74)专利代理 机构 深圳市科吉华烽知识产权事 务所(普通 合伙) 44248 专利代理师 胡吉科 (51)Int.Cl. C07K 16/18(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (56)对比文件 CN 105452292 A,2016.0 3.30 US 2010041074 A1,2010.02.18 GB 247546 6 A,2011.05.25 CN 10195195 3 A,2011.01.19 Liu Yang等.N ovel immunohistochemical monoclonal antibody a gainst human glucose-regulated protei n 78. 《Hybridoma (Larchmt)》 .201 1,第30卷(第6期), 王明珠等.葡萄糖调节蛋白78在肿瘤中作用 的研究进 展. 《科技展望》 .2016,(第3 5期),220- 222. 审查员 王航 (54)发明名称 一种靶向葡萄糖调节蛋白78的纳米抗体及 其应用 (57)摘要 本发明提供了一种靶向葡萄糖调节蛋白78 的纳米抗体及其应用， 所述靶向葡萄糖调节蛋白 78的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区为如 SEQ ID NO:2所示的CDR1、 如SEQ  ID NO:4所示的 CDR2、 如SEQ  ID NO:6所示的CDR3； 或如SEQ  ID  NO:9所示的CDR1、 如SEQ  ID NO:11所示的CDR2、 如SEQ ID NO:13所示的CDR3。 本发明的靶向葡萄 糖调节蛋白78的纳米抗体， 与葡萄糖调节蛋白78 的亲和力均在纳摩尔水平， 具有较高的亲和力， 对细胞膜表面的GRP78蛋白具有特异性识别能 力。 权利要求书1页 说明书5页 序列表5页 附图4页 CN 114163526 B 2022.06.21 CN 114163526 B 1.靶向葡萄糖调节蛋白78的纳米抗体， 其特征在于： 所述靶向葡萄糖调节蛋白78的纳 米抗体的氨基酸序列的互补 决定区由如SEQ  ID NO:2所示的CDR1、 如SEQ  ID NO:4所示的 CDR2和如SEQ  ID NO:6所示的CDR3组成。 2.根据权利要求1所述的靶向葡萄糖调节蛋白78的纳米抗体， 其特征在于： 所述靶向葡 萄糖调节蛋白78的纳米抗体的氨基酸序列的框架区包括SEQ  ID NO:1所示的FR1、 如SEQ  ID  NO:3所示的FR2、 如SEQ  ID NO:5所示的FR3、 如SEQ  ID NO:7所示的FR4。 3.根据权利要求2所述的靶向葡萄糖调节蛋白78的纳米抗体， 其特征在于： 所述靶向葡 萄糖调节蛋白78的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ  ID NO:15所示。 4.靶向葡萄糖调节蛋白78的纳米抗体， 其特征在于： 所述靶向葡萄糖调节蛋白78的纳 米抗体的氨基酸序列的互补决定区由如SEQ  ID NO:9所示的CDR1、 如SEQ  ID NO:11所示的 CDR2和如SEQ  ID NO:13所示的CDR3组成。 5.根据权利要求4所述的靶向葡萄糖调节蛋白78的纳米抗体， 其特征在于： 所述靶向葡 萄糖调节蛋白78的纳米抗体的氨基酸序列的框架区包括SEQ  ID NO:8所示的FR1、 如SEQ  ID  NO:10所示的FR2、 如SEQ  ID NO:12所示的FR3、 如SEQ  ID NO:14所示的FR4。 6.根据权利要求5所述的靶向葡萄糖调节蛋白78的纳米抗体， 其特征在于： 所述靶向葡 萄糖调节蛋白78的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ  ID NO:16所示。 7.一种核酸， 其特征在于， 所述核酸为： 编码如权利要求1~6任意一项所述的靶向葡萄 糖调节蛋白78的纳米抗体的核酸或其互补序列。 8.一种表达载体， 其包 含如权利要求7 所述的核酸。 9.一种宿主细胞， 其包 含如权利要求8所述的表达载体。 10.权利要求1~6任意一项所述的靶向葡萄糖调节蛋白78的纳米抗体在制备靶向葡萄 糖调节蛋白78的检测试剂、 活体成像探针、 嵌合型免疫细胞或治疗性 抗体中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114163526 B 2一种靶向葡萄糖调节蛋白78的纳米抗体及其应用 技术领域 [0001]本发明属于免疫学或分子生物学技术领域， 尤其涉及一种靶向葡萄糖调节蛋白78 的纳米抗体及其应用。 背景技术 [0002]葡萄糖调节蛋白78 （glucose  regulated  protein 78 kDa, GRP78） ， 是1977年Ira   Pastan等人在无葡萄糖培养的鸡胚成纤维细胞中发现的一种分子量为78  kDa的蛋白， 与免 疫球蛋白重链结合蛋白 （binding  immunoglobulin  protein,  BIP） 完全相同， 故而又称为 免疫球蛋白重链结合蛋白 （BiP） 是重要的内质网分子伴侣， 参与内质网应激和蛋白质的折 叠转运， 对肿瘤增殖、 侵袭、 转移以及血管形成至关重要。 GRP78  蛋白全长由两个功能结构 域组成， 包括核苷酸结合域 （nucleotide ‑binding domain, NBD） ， 能够结合ATP， 和底物结 合域 （substrate ‑binding domain, SBD） ， 能够结合多肽/蛋白。 GRP78  广泛存在于细胞质 内， 但在肿瘤微环境缺氧、 缺葡萄糖、 pH  降低等应激环境下， 会从胞质转运到膜表面， 即表 面GRP78 （cell  surface GRP78, csGRP78） 。 研究发现， csGRP78  在多种高度恶性肿瘤 （如 TNBC、 胶质母细胞瘤、 胃癌） 中高表达； csGRP78主要以外周蛋白的形式存在于质膜上， 并与 其他细胞表面蛋白 （如糖 基磷脂酰肌醇锚定蛋白） 相互作用， 介导肿瘤 细胞的信号 转导。 [0003]此外， GPRP78基因的表达谱显示， 在不同的癌 症类型中， 高度恶性和侵袭性胶质母 细胞瘤的c sGRP78表达量最高， 肺癌、 乳 腺癌、 胃癌、 结肠癌和肝癌以及血管生 成的内皮细胞 也有高表达的报道。 这些发现证实了c sGRP78可以同时存在于恶性肿瘤细胞和内皮细胞上， 但在正常细胞上表达很少， 这表明csGRP78作为内质网蛋白质稳态失调的产 物， 可以作为癌 细胞特异性生物标记 物、 癌症成像和治疗的靶点， 也是选择性药物递送的潜在工具。 [0004]单克隆抗体分子量大、 组织渗透性很差， 大大限制了单克隆抗体在实体瘤中的有 效性。 在骆驼科体内发现的单链抗体 （HCAb） ， 其可变 区 （VHH） 即为纳米抗体 （Nb） 。 纳米抗体 相对分子质量约为15  kDa， 是传统抗体的1/10左右。 纳米抗体稳定性强、 可溶性好、 可原核 表达, 此外， 纳米抗体基因序列与人VH  基因家族III  序列有80%的同源性， 因此免疫原性 较低。 最后， 相比单恋抗体scFv， 纳米抗体仍保留了较好的亲和力和特异性。 因此纳米抗体 在新药开发和疾病诊断领域显示了独特的潜力。 但是到目前为止， 也未见与GRP78  蛋白结 合性好、 亲和力高的纳米抗体的相关报道。 发明内容 [0005]针对以上技术问题， 本发明公开了一种靶向葡萄糖调节蛋白78的纳 米抗体及其应 用， 与葡萄糖调节蛋白78结合性好， 而且 亲和力高， 可以用于特异 性识别葡萄糖调节蛋白78 中。 [0006]对此， 本发明采用的技 术方案为： [0007]一种靶向葡萄糖调节蛋白78的纳 米抗体， 所述靶向葡萄糖调节蛋白78的纳 米抗体 的氨基酸序列的互补决定区为如SEQ  ID NO:2所示的CD R1、 如SEQ  ID NO:4所示的CD R2、 如说　明　书 1/5 页 3 CN 114163526 B 3