(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111290860.X (22)申请日 2021.11.02 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113999320 A (43)申请公布日 2022.02.01 (73)专利权人 深圳先进技 术研究院 地址 518055 广东省深圳市西丽大 学城学 苑大道1068号 专利权人 中国科学院深圳理工大 学 （筹） (72)发明人 万晓春　曹国政　 (74)专利代理 机构 北京中巡通大知识产权代理 有限公司 1 1703 专利代理师 王霞 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01)C12N 15/62(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) 审查员 辛铁钢 (54)发明名称 以CD28和4-1BB为共刺激结构域的靶向 CD276的嵌合 抗原受体及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种以CD28和4 ‑1BB为共刺激 结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体及其应用， 属于生物医药技术领域。 本发明公开的靶向 CD276的嵌合抗原受体T细胞以CD28和4 ‑1BB为共 刺激结构域， 使得所述的靶向CD276的嵌合抗原 受体T细胞对表达CD276的阳性肿瘤细胞系有强 的杀伤活性， 在体内具有更强的杀伤活性和持久 性， 并有利于记忆表型T细胞的产生。 本发明经过 体外功能测试， 靶向CD276的嵌合抗原受体T细胞 对CD276阳性 肝癌细胞系有杀伤活性。 权利要求书2页 说明书6页 序列表13页 附图1页 CN 113999320 B 2022.09.27 CN 113999320 B 1.一种以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体， 其特征在于， 该 靶向CD276的嵌合 抗原受体的氨基酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 2.根据权利要求1所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受 体， 其特征在于， 编码所述靶向CD276的嵌合 抗原受体的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示。 3.根据权利要求1所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受 体， 其特征在于， 该靶向CD276的嵌合抗原受体包括从氨基端到羧基端依次连接的靶向 CD276的单链抗体、 胞外铰链区、 跨膜区、 共刺激结构域、 信号转导区、 P2A和荧光蛋白EGFP的 氨基酸序列。 4.根据权利要求3所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受 体， 其特征在于， 所述靶向CD276的单链 抗体的氨基酸序列如SEQ  ID NO:3所示， 编码该靶向 CD276的单链抗体的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示。 5.根据权利要求3所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受 体， 其特征在于， 所述胞外铰链区为CD8α 铰链区， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO:5所示， 编码该 CD8α 铰链区的核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 6.根据权利要求3所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受 体， 其特征在于， 所述跨膜区为CD8α 跨膜区， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO:7所示， 编码该CD8α 跨膜区的核苷酸序列如SEQ  ID NO:8所示。 7.根据权利要求3所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受 体， 其特征在于， 所述共刺激结构域由CD28胞内区、 4 ‑1BB胞内区依次串联构成； 其中： 所述CD28胞内区的氨基酸序列如SEQ  ID NO:9所示， 编码该CD28胞内区的核苷酸序列 如SEQ ID NO:10所示； 所述4‑1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ  ID NO:11所示， 编码该4 ‑1BB胞内区的核苷酸序 列如SEQ ID NO:12所示。 8.根据权利要求3所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受 体， 其特征在于， 所述信号转导区为CD3ζ 胞内区， 该CD3ζ 胞内区的氨基酸序列如SEQ  ID NO: 13所示； 编码该CD3ζ 胞内区的核苷酸序列如SEQ  ID NO:14所示。 9.根据权利要求3所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受 体， 其特征在于， 所述P2A氨基酸序列如SEQ  ID NO:15所示； 编码P2A的核苷 酸序列如SEQ  ID  NO:16所示； 所述荧光蛋白EGFP的氨基酸序列如SEQ  ID NO:17所示； 编码荧光蛋白EGFP的核 苷酸序列如SEQ  ID NO:18所示。 10.一种靶向CD276的嵌合抗原受体T细胞， 其特征在于， 包括权利 要求1～9中任意一项 所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合 抗原受体。 11.一种靶向CD276的嵌合 抗原受体T细胞的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)将以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体CAR ‑CD276‑28BBζ 的 编码基因插 入到pWPXLd载体中， 得到pWPXL  d‑CAR‑CD276‑28BB ζ 重组质粒； 其中， 靶向CD276的嵌合抗原受体CAR ‑CD276‑28BBζ 的编码基因的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:2所示； 2)将所述pWPXLd ‑CAR‑CD276‑28BBζ重组质粒与包膜质粒、 包装质粒共转染宿主细胞， 得到重组慢病毒；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113999320 B 23)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细 胞， 经分离获得靶向CD276的嵌合抗原受体T 细胞。 12.根据权利 要求11所述的靶向CD276的嵌合抗原受体T细胞的制备方法， 其特征在于， 步骤2)中， 所述包膜质粒为PMD2G， 所述包装质粒为psPAX2， 所述宿主细胞为HEK293T细胞； 步骤3)中， CD3阳性T淋巴细胞 是从人外周血 单个核细胞中分离获得。 13.一种重组病毒载体， 其特征在于， 包含靶向CD276的嵌合抗原受体T细胞的CAR ‑ CD276‑28BB ζ 的编码基因， 该编码基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2或SEQ  ID NO:19所示。 14.根据权利要求13所述的重组病毒载体， 其特征在于， 所述靶向CD276的嵌合抗原受 体T细胞的CAR ‑CD276‑28BBζ 的编码基因， 自5 ’端到3’端依次由CD8α信号肽的编码基因、 靶 向CD276的单链抗体的编码基因、 CD8α胞外铰链区的编码基因、 CD8α跨膜区的编码基因、 CD28胞内区编码基因、 4 ‑1BB胞内区的编码基因、 CD3ζ 胞内区的编码基因、 自剪切元件P2A的 编码基因和荧 光蛋白EGFP的编码基因串联相连； 其中： CAR‑CD276‑28BB ζ 的氨基酸序列如SEQ  ID NO:20所示； CD8α 信号肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO:21所示； CD8α 信号肽的氨基酸序列如SEQ  ID NO:22所示。 15.权利要求1～9中任意一项所述的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌 合抗原受体、 权利要求10所述的靶向CD276的嵌合抗原受体T细胞或权利要求 13所述的重组 病毒载体在制备治疗肝癌的药物中的应用。 16.如权利要求15所述的应用， 其特征在于， 该药物对表达CD276的阳性肿瘤细胞杀伤 活性强、 作用时间持久， 且能够增 加记忆表型T细胞的生成。 17.一种治疗肝细胞癌的药物， 其特征在于， 该药物包括权利要求1～9中任意一项所述 的以CD28和4 ‑1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体、 权利要求10所述的靶向 CD276的嵌合 抗原受体T细胞或权利要求13所述的重组病毒载体。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113999320 B 3