(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111368423.5 (22)申请日 2021.11.18 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 梁廷波　胡奇达　王蒙　赵昕昱　 黄珺明　邵世怡　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 林超 (51)Int.Cl. A61K 9/51(2006.01) A61K 31/7068(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61K 47/46(2006.01)A61P 1/18(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 5/09(2010.01) (54)发明名称 具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞 膜仿生纳米微球及其方法 (57)摘要 本发明公开了一种具有胰腺癌微环境靶向 的基因工程化细胞膜仿生纳米微球及其方法。 以 慢病毒转染的方式在胰腺癌细胞KPC表面表达肿 瘤相关巨噬细胞靶向肽， 构建巨噬细胞靶向肽 M2pep过表达的胰腺癌细胞系； 使用复乳法将胰 腺癌一线化疗 药物吉西他滨装 载于聚乳酸 ‑乙醇 酸聚合物中， 自组装形成聚乳酸 ‑乙醇酸纳米微 球； 使用梯度离心法提取胰腺癌细胞系其细胞膜 囊泡， 包载聚乳酸 ‑乙醇酸纳米微球， 得到胰腺癌 微环境强化靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米 微球。 本发 明细胞膜仿生纳米微球能够大量富集 胰腺癌组织中， 减少体内其他组织的非特异性蓄 积， 实现对胰腺癌组织的特异性靶向作用， 具有 对胰腺癌组织大量精准递送化疗药吉西他滨的 优势。 权利要求书2页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114146064 A 2022.03.08 CN 114146064 A 1.一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球， 其特征在于： 所述 的纳米体系为核壳结构， 核壳结构的外层壳为基因工程化过表达跨膜蛋白的胰腺癌细胞的 细胞膜； 核壳结构的内层核为包载吉西他滨的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物微球。 2.根据权利要求1所述的一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微 球， 其特征在于： 所述的过表达跨膜蛋白为过表达巨噬细胞靶向肽M2pep， 主要由信号肽、 靶 向肽、 增强型绿色荧光蛋白、 3XFLAG标记肽、 糖基化磷酯酰肌醇锚定蛋白依次连接构成； 所 述的信号肽为 IL‑2跨膜蛋白信号肽， 靶向肽为巨噬细胞 特异性靶向肽。 3.根据权利要求1所述的一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微 球， 其特征在于： 所述的巨噬细胞 特异性靶向肽的氨基酸序列为Y EQDPWGVKWWY。 4.根据权利要求1所述的一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微 球， 其特征在于： 所述包载吉西他滨的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物微球中， 聚乳酸： 聚羟基乙酸 的质量比例为1： 1， 聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物与吉西他滨的质量比为5： 1～1： 5 。 5.根据权利要求1～4任一所述基因工程化细胞膜仿生纳米微球的制备方法， 其特征在 于： 所述制备 方法具体包括： 步骤一： 基因工程 化表达M2pep靶向肽 细胞系KPCM2pep+的构建： 构建过表达巨噬细胞靶向肽M2pep及其对应的慢病毒， 通过慢病毒转染过表达巨噬细 胞靶向肽M2pep到胰腺癌细胞上， 建立在细胞膜上稳定表达过表达巨噬细胞靶向肽M2pep的 胰腺癌细胞系； 步骤二： KPCM2pep+细胞膜分离和纯化： 收集细胞膜上稳定表达过表达巨噬细胞靶向肽M2pep的胰腺癌细胞， 使用含有苯甲基 磺酰氟的细胞裂解液进行裂解细胞， 于液氮和常温下反复冻 结融化细胞溶液， 使用梯度离 心法获得细胞膜 碎片溶液； 步骤三： 包载吉西他滨分子的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物纳米微球制备： 步骤四： 基因工程 化细胞膜仿生纳米微球制备： 混合细胞膜碎片溶液和含有吉西他滨分子的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物纳米微球， 超声 处理后使用脂质体挤出器挤过聚碳酸酯多孔膜， 使用脂质体挤出器处理重复多次， 获得大 小分布均一的基因工程 化细胞膜仿生纳米微球。 6.根据权利要求5所述的制备 方法， 其特 征在于： 所述步骤一中， 将胰腺癌细胞KPC铺到6孔板中， 37℃培养箱内培养24小时， 加入20微 升/孔的过表达巨噬细胞靶向肽M2pep 对应的慢病毒， 37℃培养2 4小时得到基因工程化过表 达巨噬细胞靶向肽M2pep的胰腺癌细胞系KPCM2pep+。 7.根据权利要求5所述的制备 方法， 其特 征在于： 所述步骤二中， 用细胞刮子轻柔刮下细 胞， 1000转/分钟离心5分钟收集细胞， 随后加入 1毫升含有质量分数1％的苯甲基磺酰氟的细胞裂解液， 依次放在液氮和常温下反复冻结融 化直到细胞破裂； 随后在4℃和700g条件下离心10分钟， 收集上清的溶液， 最后14000g离心 30分钟， 收集 沉淀为KPCM2pep+细胞膜碎片。 8.根据权利要求5所述的制备 方法， 其特 征在于： 所述步骤三具体为， 使用超声仪器， 将聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物的乙腈溶液逐滴加入吉 西他滨的乙醇溶液中超声处理获得混合溶液， 将得到的混合溶液使用超滤管离心去除游离权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114146064 A 2的吉西他滨分子， 再使用针式滤器过滤除去直径较大的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物微球， 得到 含有大小分布均一的吉西他滨分子的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物纳米微球。 9.根据权利要求5所述的制备 方法， 其特 征在于： 所述步骤三具体为， 配制2克/升的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物的80wt％乙腈溶液和0.75 克/升的吉西他滨的4wt％乙醇溶液， 在20kHz频率和40W功率的超声下， 将聚乳酸 ‑羟基乙酸 共聚物溶液逐滴加入吉西他滨溶液中， 质量混合比例1： 1， 超声处理10分钟得到混合溶液， 将得到的混合溶液使用Amicon  ultra‑4超滤管3000转/分钟离心30分钟， 取上层溶液使用 0.22微米针式滤器过滤3次， 得到平均直径0.22 微米的包载吉西他滨分子的聚乳酸 ‑羟基乙 酸共聚物纳米微球。 10.根据权利要求5所述的制备 方法， 其特 征在于： 所述的步骤四中， 使用超声细 胞破碎仪在20kHz频率和20W功率下， 按照质量比1： 2超声 混合细胞膜 碎片溶液和含有吉西他滨分子的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物纳米微球。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114146064 A 3