(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111334885.5 (22)申请日 2021.11.11 (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号 (72)发明人 张成　杨静　王亚辉　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 黄爽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6823(2018.01) B82Y 30/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 47/54(2017.01)A61K 47/62(2017.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 基于纳米孔技术的DNA-纳米颗粒复合材料 及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明提供一种基于纳米孔技术的DNA ‑纳 米颗粒复合材料及其制备方法与应用。 该复合材 料是将由SEQ  ID NO:1‑4所示的四条核酸 分子退 火形成的四面体DNA与带有巯基修饰的纳米颗粒 的DNA单链(SEQ  ID NO:5)进行杂交得到的。 本发 明基于纳米孔技术， 首次提出一种新型的DNA携 带纳米颗粒(如AuNPs)过孔的检测机制， 金颗粒 结合在DNA四面体外部。 加入待测疾病分子后， 与 四面体‑金颗粒载体正确匹配的疾病分子， 能将 四面体外的金颗粒释放。 通过琼脂糖凝胶电泳和 纳米孔装置检测， 显示该疾病分子的检测具有很 强的特异性， 只有匹配的疾病分子能释放金颗 粒。 该复合材料在疾病检测与疾病治疗等领域的 应用前景广阔。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图5页 CN 114250300 A 2022.03.29 CN 114250300 A 1.基于纳米孔技术的DNA ‑纳米颗粒复合材料， 其特征在于， 所述复合材料是将由SEQ   ID NO:1‑4所示的四条核酸分子退火形成的四面体DNA与带有巯基修饰的纳米颗粒的DNA单 链进行杂交得到的， 所述DNA单链的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示。 2.根据权利要求1所述的复合材料， 其特征在于， SEQ  ID NO:1‑4所示的核酸分子按等 摩尔比混合退火。 3.根据权利要求1或2所述的复合材料， 其特征在于， 所述纳米颗粒为纳米金颗粒， 粒径 为1‑100nm。 4.权利要求1 ‑3任一项所述复合材 料的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)四面体DNA的制备： 将SEQ  ID NO:1‑4所示的四条核酸分子按等摩尔比混合于1 × TAE/Mg2+缓冲液中， 94℃保持4分钟， 然后在5分钟内匀速降温至25℃， 退火形成四面体DNA； 其中， 1×TAE/Mg2+缓冲液的组成如下： 40mM  Tris， 20mM乙酸， 2mM  EDTA和12.5mM乙酸 镁， pH8.0； (2)巯基修饰的DNA单链的制备： SEQ  ID NO:5所示 的DNA单链经过巯基修饰， 得到巯基 修饰的DNA单链； (3)带有巯基修饰的纳米颗粒的DNA单链的制备： 将上述巯基修饰的DNA单链与纳米颗 粒混合， 室温反应过夜， 加入保护剂寡聚乙二醇， 得到带有巯基修饰的纳米颗粒的DNA单链； (4)DNA‑纳米颗粒复合材料的制 备： 将四面体DNA和带有巯基修饰的纳米颗粒的DNA单 链于室温进行杂交。 5.权利要求1 ‑3任一项所述复合材 料的以下任一应用： 1)用于制备癌症检测试剂和试剂盒； 2)用于制备癌症治疗药物； 3)用于制备 药物递送载体； 所述癌症是指高表达特异性分子miR ‑21的癌症， 包括乳腺癌、 宫颈癌。 6.基于纳米孔技术的癌症检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1 ‑3任一 项所述的复合材 料， 纳米孔检测装置和缓冲液。 7.根据权利要求6所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述纳米孔检测装置为固态氮化硅纳米 孔板， 厚度3 0nm， 孔径3 0nm； 和/或 所述缓冲液为0.5 M氯化钾溶 液。 8.癌症治疗药物， 其特征在于， 所述药物是在权利要求1 ‑3任一项所述复合材料的纳米 颗粒表面 修饰具有 治疗效应的蛋白得到的。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114250300 A 2基于纳米孔 技术的DNA ‑纳米颗粒复合材料及其制备方 法与 应用 技术领域 [0001]本发明涉及纳米孔检测 领域， 具体地说， 涉及一种基于纳米孔技术的DNA ‑纳米颗 粒复合材 料及其制备 方法与应用。 背景技术 [0002]纳米孔技术是一种用于检测和表征溶液中单个分子的通用技术， 其区别于传统检 测手段的特点为无需标记、 检测通量高、 灵敏度高、 操作简单等特点， 这些特点决定了纳米 孔技术在分子检测方面具有较为广泛的应用前景。 纳米孔主要分为生物纳米孔和固态纳米 孔两类， 对于生物纳米孔而言， 最常用的是生物蛋白纳米孔， 例如α ‑溶血素(英文简称α ‑ HL)。 早期生物纳米孔主要用来检测核酸， 但是生物蛋白纳米孔的空间和时间分辨率比较低 且自身在稳定性、 持久性等方面存在不足， 固态纳米孔应运而生。 固态纳米孔属于人造纳米 孔， 它的尺寸可控， 有更好的稳定性， 更加灵敏且可重复利用， 是检测蛋白分子的理想 工具。 [0003]纳米孔单分子传感器相比其他传统单分子检测技术而言具有低成本高通量的优 势。 在固态纳米孔装置中， 当一个带电生物分子在外加电场力的作用下电泳穿过纳米孔时， 由于其物理占位作用及其与纳米孔壁间的强相互作用， 离子电流会产生瞬间变化， 表现为 短时的尖 峰， 每个尖 峰对应一个易位事件， 通过对电流变化以及易位时间的分析可以获取 待测分子的带电特性， 形状大小以及运动行为等特征。 因此， 纳米孔被广泛应用于一些单分 子的检测中， 如 核酸分子， 蛋白质， 核酸与蛋白的结合物 等， 甚至用于单个DNA碱基以及蛋白 质氨基酸的识别。 [0004]纳米科技是21世纪前沿科学技术的代表领域之一， 已经成为世界各国重要的科技 发展战略。 由于纳米颗粒处于微观和宏观物质之间的区域， 纳米颗粒具有一些特异的理化 性质， 如光学、 化学、 点学。 纳米金颗粒(AuNPs)， 是直径在 1‑100纳米的金属颗粒。 纳米金颗 粒的表面稳定性高且表面积大， 具有较强的催化作用， 重要的是可与多种生物分子(DNA、 RNA、 蛋白质)作用而不影响其生物活性。 金纳米颗粒的表面根据制作方法 的不同可以带正 电荷或者负电荷， 甚至不带电荷。 DNA由于本身的磷酸骨架， 在中性环境中都带有负电。 将 DNA做成载体， 携载金颗粒过纳米孔有增强或者抑制的作用， 这些特点 实现了与纳米孔技术 的结合， 而且纳米金颗粒作为纳米实验的一个重要的工具， 不仅能在其金表面与核酸结合， 而且可以通过适配体与蛋白结合， 从而增加了实验的多样性。 可通过实验设计来识别特定 的蛋白， 甚至可以做成癌症治疗的靶向药物。 [0005]癌症是全球发病和死亡的主要原因。 预防是治愈疾病最佳的良药， 尤其是对于癌 症来说， 如果能对癌症进 行提前的预测并进 行干预， 无疑能达到最好的结果。 由于癌症的复 杂性， 联合采用多种技术可以有效提高诊断的准确性。 总体而言， 核酸检测仍然 是诊断的金 标准。 利用纳米孔 技术的特性， 可为疾病分子检测方面 提供新途径。说　明　书 1/7 页 3 CN 114250300 A 3