(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111364878.X (22)申请日 2021.11.17 (71)申请人 南京工业大 学 地址 211816 江苏省南京市浦口区浦珠南 路30号 (72)发明人 张亚男　王朋飞　杨昕刚　郭苗　 胡玉冰　 (74)专利代理 机构 南京行高知识产权代理有限 公司 32404 代理人 王菊花 (51)Int.Cl. A61K 47/64(2017.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 33/242(2019.01) A61P 35/00(2006.01)B82Y 5/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) (54)发明名称 用于肿瘤化疗与放疗联合治疗纳米载体、 制 备方法及应用 (57)摘要 本发明提供一种用于肿瘤化疗与放疗联合 治疗纳米载体、 制备方法及应用， 所述纳米药物 载体由两亲性肽类树状大分子构成， 亲水端由 mPEG构成， 疏水端由化疗药物阿霉 素(DOX)构成， 包括作为载体的肽类树状大分子纳米颗粒以及 在肽类树状大分子纳米颗粒的内部空腔负载的 放疗增敏剂金纳米颗粒(AuNPs)。 基于本发明制 备的化疗与放疗联合治疗纳米颗粒药物载体粒 径在90‑180nm， 可通过内吞作用进入肿瘤细胞细 胞， 有效减小了小分子化疗药物在体内循环中的 快速代谢， Au NPs在X射线照射下有效增强细胞内 ROS水平、 使线粒体电位失衡、 影 响细胞周期进而 协同化疗药物 诱导细胞凋亡抑制癌细胞的增长， 达到抑制肿瘤的目的。 权利要求书3页 说明书8页 附图7页 CN 114053428 A 2022.02.18 CN 114053428 A 1.一种用于肿瘤化疗与放疗联合治疗纳米载体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 步骤1、 选用赖氨酸作 为原料， 以乙二胺为核心， 采用发散法合成G1 ‑G3代肽类树状大分 子； 步骤2、 在G1 ‑G3代肽类树状大分子表面修饰mPEG， 作为酸性敏感键， 合成获得Boc ‑Hyd‑ G1‑G3‑mPEG(Boc ‑Hyd‑PP)纳米颗粒作为载体； 步骤3、 将化疗药物DOX通过化学键与上述获得的纳米颗粒链接， 获得DOX ‑Hyd‑PP； 步骤4、 采用原位复合法， 将包覆在纳米颗粒的空腔内金离子进行原位还原， 还原为纳 米银金负载其中， 得到双载 药纳米颗粒DOX ‑Hyd‑PP@AuNPs。 2.根据权利要求1所述的用于肿瘤化疗与放疗联合治疗纳米载体的制备方法， 其特征 在于， 所述 步骤1的具体处 理包括以下步骤： 将单Boc保护的乙二胺、 Z ‑Lys(Z)‑OH、 HBTU和HOBT在氮气气 氛下溶于DMF 中， 加入DIEA， 冰浴反应30min， 撤去冰浴后继续反应24h； 反应结束后旋转蒸发除去 溶剂， 加入DCM溶解， 用 饱和NaHCO3、 1mol/L HCl和饱和NaCl水溶液洗三次， 水洗后加入无水硫酸镁干燥过夜， 过滤 后旋转蒸发至10 mL， 用二氯甲烷/甲醇10:1流动相过凝胶色谱柱进一步提纯， 得到G1代肽类 树状大分子； 将上一步反应产物G1在氮气气氛下溶于DCM， 加入TFA， 冰浴反应30min， 撤去冰浴后继 续反应7h； 反应结束后旋转蒸发溶剂， 用冰乙醚沉淀， 收集白色固体； 将收集的白色固体产 物与Boc‑Lys(Boc) ‑OH、 HBTU、 HOBT在氮气气氛下溶于DMF中， 加入DIEA， 冰浴反应30min， 撤 去冰浴后继续反应24h； 反应结束后旋转蒸发除去溶剂， 加入DCM溶解， 用饱和碳酸氢钠、 1mol/L盐酸和 饱和NaCl水溶液洗三次， 水洗后加入无水硫酸镁干燥过夜， 过滤后旋转蒸发 至15mL， 用二氯甲烷/甲醇10:1流动相过凝胶色谱柱进一步提纯， 得到G1 ‑G1代肽类树状大 分子； 将上一步反应产物G1 ‑G1在氮气气氛下溶于DCM， 加入TFA， 冰浴反应30min， 撤去冰浴后 继续反应7h， 反应结束后旋转蒸发除去溶剂， 用冰乙醚沉淀， 收集白色固体； 将白色固体产 物与Boc‑Lys(Boc) ‑OH、 HBTU、 HOBT在氮气气氛下溶于DMF中， 加入DIEA， 冰浴反应30min， 撤 去冰浴后继续反应48h； 反应结束后旋转蒸发除去溶剂， 加入DCM溶解， 用饱和NaHCO3、 1mol/ LHCl和饱和NaCl水溶液洗三次， 水洗后加入 无水硫酸镁干燥过夜， 过滤后旋转蒸发至20mL， 用二氯甲烷/甲醇10:1流动相过凝胶色谱柱进一 步提纯， 得到G1 ‑G2代肽类树状大分子； 将上一步反应产物G1 ‑G2在氮气气氛下溶于DCM， 加入TFA， 冰浴反应30min， 撤去冰浴后 继续反应7h， 反应结束后旋转蒸发除去溶剂， 用冰乙醚沉淀， 收集白色固体； 将白色固体产 物与Boc‑Lys(Boc) ‑OH、 HBTU、 HOBT在氮气气氛下溶于DMF中， 加入DIEA， 冰浴反应30min， 撤 去冰浴后继续反应72h。 反应结束后旋转蒸发除去溶剂， 加入DCM溶解， 用饱和碳酸氢钠、 1mol/L盐酸和 饱和NaCl水溶液洗三次， 水洗后加入无水硫酸镁干燥过夜， 过滤后旋转蒸发 至25mL， 用二氯甲烷/甲醇10:1流动相过凝胶色谱柱进一步提纯， 得到G1 ‑G3代肽类树状大 分子。 3.根据权利要求2所述的用于肿瘤化疗与放疗联合治疗纳米载体的制备方法， 其特征 在于， 所述 步骤2的具体处 理包括以下步骤： 将mPEG‑OH500、 丁二酸酐、 DMAP和三乙胺溶解于四氢呋喃中， 快速搅拌下反应24h； 反应权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114053428 A 2结束后旋转蒸发除去溶剂， 加入少量DCM溶解， 在剧烈搅拌下加入冰乙醚沉淀， 真空干燥后 得到白色固体产物mPEG ‑COOH， 其中mPEG ‑OH500： 丁二酸酐： DMAP： 三乙胺的摩尔比为1:1.5: 1.05:1.05； 称取G1‑G3肽类树状大分子在氮气气氛下溶于DCM， 加入TFA， 冰浴反应30min， 撤去冰浴 后继续反应7h， 反应结束后旋转蒸发除去溶剂， 用冰乙醚沉淀， 收集白色固体； 将白色固体 产物mPEG ‑COOH， EDC和NHS溶于10mL水中搅拌活化1h， 活化后匀速滴入上述脱保护产物水溶 液中， 常温下反应48 h， 反应结束后用PBS缓冲液透析3次， 换去离子水透析三次， 冻干后得到 白色固体G1 ‑G3‑mPEG； 其中G1 ‑G3肽类树状大分子： mPEG ‑COOH： EDC： NHS的摩尔比为1:16: 24:24； 将丁二酸酐和DMAP溶于DCM中， 在剧烈搅拌下缓慢滴加溶于DCM的叔丁氧羰基肼； 反应 结束后转转蒸发去除溶剂， 抽真空干燥24h得到羧酸化的叔丁氧羰基肼， 其中丁二酸酐： 叔 丁氧羰基肼的摩尔比为1.5： 1； 将G1‑G3‑mPEG500用无水 甲醇溶解， 加入Pd/C(46.3mg)在氢气气氛下反应48h， 以脱除 Cbz保护； 反应结束后抽滤去除钯碳， 旋转蒸发 除去溶剂； 将羧酸化的叔丁氧羰基肼、 EDC和 NHS溶于5mL水中， 活化反应1h； 将脱除Cb z保护的G1 ‑G3‑mPEG500溶于5mL水中， 缓慢滴加活 化后的羧酸化的叔丁氧羰基肼， 反应48h； 反应结束后用去离子水透析3天， 冻干后得到Boc ‑ Hyd‑G1‑G3‑mPEG， 其中G1 ‑G3‑mPEG500： 羧酸化的叔丁氧羰基肼： EDC： NHS的摩尔比为1:4:8: 8。 4.根据权利要求3所述的用于肿瘤化疗与放疗联合治疗纳米载体的制备方法， 其特征 在于， 述步骤3的具体处 理包括以下步骤： 将Boc‑Hyd‑G1‑G3‑mPEG在氮气气氛下溶于DCM， 加入TFA， 冰浴反应30min， 撤去冰浴后 继续反应7h， 反应结束后旋转蒸发除去溶剂， 用冰乙醚沉淀， 收集白色固体； 将收集的白色 固体与DOX.HCl溶解在DMF， 加入一滴TFA催 化反应， 避光条件下反应48h。 反应结束后旋转蒸 发去除溶剂， 加入少量去离子水溶解， 在4℃条件 下去离子水透析2 4h， 冻干后的到产 物为载 药纳米颗粒DOX ‑Hyd‑G1‑G3‑mPEG(DOX ‑Hyd‑PP)， 其中Boc ‑Hyd‑G1‑G3‑mPEG： DOX.HCl的摩尔 比为1:4。 5.根据权利要求4所述的用于肿瘤化疗与放疗联合治疗纳米载体的制备方法， 其特征 在于， 所述 步骤4的具体处 理包括以下步骤： 将1w％的氯金酸加到20mL水中， 用0.1mol/L的NaOH调节pH至中性， 将DOX ‑hyd‑G1‑G3‑ mPEG溶解在氯金酸溶 液中搅拌3 0min， 快速加入的硼氢化钠溶 液， 继续搅拌3 h； 搅拌结束后用去离子水透析24h， 冻干得到双载药纳米颗粒DOX ‑hyd‑G1‑G3‑mPEG@ AuNPs(DOX ‑Hyd‑PP@AuNPs)， 其中， DOX ‑hyd‑G1‑G3‑mPEG： AuNPs的摩尔比为1: 8。 6.根据权利要求4所述的用于肿瘤化疗与放疗联合治疗纳米载体的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤3中， 冻 干后得到的载药纳米颗粒DOX ‑Hyd‑G1‑G3‑mPEG， 其纳米颗粒粒径保 持在120‑130nm之间； 所述步骤4中， 冻干得到的双载药纳米颗粒DOX ‑hyd