(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111347624.7 (22)申请日 2021.11.15 (71)申请人 上海交通大 学医学院 地址 200025 上海市黄浦区重庆南路280号 (72)发明人 王慧　牟为　巴乾　 (74)专利代理 机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 312 27 代理人 范艳静 (51)Int.Cl. A61K 31/122(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称 甲萘醌作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应 用 (57)摘要 本发明提供了一种甲萘醌作为制备治疗肠 癌肿瘤药物中的应用， 将坏死通路敏感细胞系 L929‑FADD基因敲除细胞株作为细胞增殖和坏死 的模式细胞， 从FDA药物库中筛选促进细胞死亡 的小分子化合物作为候选药物， 再将高通量筛选 得到的候选 药物与肠癌细胞HT ‑29进行具体的药 物浓度和时间的梯度检测， 明确毒性 ‑效应浓度， 从毒性和恢复效率综合评估候选药物促进肿瘤 细胞程序性死亡的药效， 获得通过促进细胞凋亡 和坏死的化合物分子甲萘醌； 实验表明， 甲萘醌 在坏死敏感细胞系L929 ‑FADD敲除株、 人细胞系 HT‑29和动物模型上均有极好的促进坏死和凋亡 的细胞程序性死亡的效果， 靶向性和安全性有保 障， 易于临床推广。 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 CN 113876752 A 2022.01.04 CN 113876752 A 1.甲萘醌作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述甲萘醌促进肿瘤细胞发生程序性死 亡。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述程序性死亡肿瘤细胞发生凋亡和坏死 细胞机制来实现。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述甲萘醌靶向MAPK8诱导细胞发生坏死 和凋亡。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述甲萘醌作为制备治疗肠癌肿瘤药物的筛选方法， 其特 征在于： 其包括以下步骤： (1)、 坏死通路敏感细胞系L9 29‑FADD基因敲除细胞株复苏、 培 养与冻存； (2)、 FDA药物库的若干小分子化合物定量， 且以肿瘤坏死因子TNF ‑α及其复合物作为阳 性对照药物； (3)、 构建用于制备治疗肿瘤的药物筛 选的细胞模型肠癌细胞HT ‑29； (4)、 检测步骤(3)中所述细胞模型的细胞存活率， 并筛 选候选药物为甲萘醌； (5)、 蛋白免疫沉淀检验步骤(4)中所述 候选药物在程序性死 亡MAPK8信号 通路的表达 。 6.根据权利要求5所述的筛选方法， 其特征在于： 步骤(1)和步骤(3)的具体方法为： 在 液氮中取出冻存的L929 ‑FADD‑KO细胞和HT ‑29细胞， 迅速置于37℃水浴， 不断晃动融解细 胞， 然后将所述L929 ‑FADD‑KO细胞和HT ‑29细胞分别 转入培养皿中加 入培养基进行过夜培 养， 细胞贴壁后换 液继续培 养， 待细胞生长 至90％密度时传代； 其中， 所述HT‑29细胞的培养基为含10％体积 分数胎牛血清的高糖DMEM培养基， 在5％体积分 数CO2、 37℃和饱和湿度条件下培 养； 所述L929 ‑FADD‑KO细胞的培养基为含10％体积分数胎牛血清的高糖DMEM培养基且加 入0.05 μL/mL pruo和0.3 3 μL/mL Nec‑1， 在5％体积分数CO2、 37℃和饱和湿度条件下培 养； 再选生长状态好、 生长 旺盛的HT ‑29细胞和L929 ‑FADD‑KO细胞用PBS洗两次后， 用胰酶 消化至细胞变圆， 用RPMI ‑1640培养基终止反应， 800rpm离心5min后弃上清， 加入冻存液， 将 细胞分装在冻存 管中， 放入程序降温盒 中保存于 ‑80℃超低温冰箱中， 2 4h后转移至液氮中； 其中， 所述RPMI ‑1640培养基内含10％体积分数胎牛血清、 1％体积分数青霉素和链霉素， 终 止反应条件为： 95％体积分数空气、 5％体积分数二氧化 碳、 37℃； 所述冻存液的成分为： 10％体积分数二甲基亚砜和90％体积分数小牛 血清。 7.根据权利要求5所述的筛选方法， 其特征在于： 步骤(2)中， 所述复合物包括TNF ‑α、 Smac模拟物Smac  mimetics和泛素半胱天 冬酶抑制剂Z ‑VAD‑FMK。 8.根据权利要求5所述的筛选方法， 其特征在于： 步骤(2)中， 所述小分子化合物定量 为： 每管体积为100 μL， 浓度为10mmol/L， 使用浓度为30 μmol/L， 所述TNF ‑α、 复合物的使用浓 度分别为3 0 μmol/L作为阳性对照药物。 9.根据权利要求5所述的筛选方法， 其特征在于： 步骤(3)中， 所述细胞模型的构建方法 为： 在白色96孔板里加入L929 ‑FADD‑KO细胞， 每孔体积为50μL， 细胞数量为5000个/孔， 经 不同药物组 处理后均放入培 养箱24h； 其中， 药物组包括：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113876752 A 2TNF‑α 组： 按1mL： 1 μL的比例在完全培养基中加入20ng/mL的TNF ‑α， 再加入至含有L929 ‑ FADD‑KO细胞白色96孔板， 每孔体积为5 0 μL， TNF‑α 的终浓度为10ng/mL； Nec‑1组： 按1mL： 0.66μL的比例在完全培养基中加入90mmol/L浓度的Nec ‑1， 再加入至 含有L929‑FADD‑KO细胞白色96孔板， 每孔体积为5 0 μL， Nec‑1的终浓度为3 0 μmol/L； TNF‑α +Nec‑1组： 按1mL： 0.66μL的比例在完全培养基中加入TNF ‑α +Nec‑1， 然后加入至 含有L929‑FADD‑KO细胞白色96孔板， 每孔体积为5 0 μL， TNF‑α 与Nec‑1的终浓度均保持不变； TNF‑α +FDA Approval  Drug组： 按1mL： 0.66 μL的比例在完全培养基中加入TNF ‑α和1068 种不同的FDA药物， 然后加入至含有 L929‑FADD‑KO细胞白色96孔板， 每孔体积为50 μL， TNF ‑α 与FDA药物的终浓度保持不变。 10.根据权利要求5所述的筛选方法， 其特征在于： 步骤(4)中， 检测所述细胞模型的细 胞存活率的方法为： 将CellTiter ‑Glo试剂加入 经过药物处理后的白色96孔板， 每孔体积为 100 μL， 再将所述白色96孔板温和 振荡混匀2min， 培养箱孵育5min， 使细胞充分裂解产生稳 定的发光信号， 检测化学发光强度， 统计在不同暴露浓度下细胞存活率， 筛 选候选药物。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113876752 A 3