ICS 65.020.01 B 16 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3630—2019 小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法 Molecular detection methods of Tilletia foetida & Tilletia caries 2019 - 07 - 23 发布 山东省市场监督管理局 2019 - 08 - 23 实施 发 布 DB37/T 3630—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 术语和定义 ......................................................................... 1 3 仪器设备 ........................................................................... 1 4 主要试剂 ........................................................................... 1 5 分子检测 ........................................................................... 1 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 小麦种子中小麦普通腥黑穗病菌冬孢子基因组 DNA 提取 ............................... 菌瘿中冬孢子基因组 DNA 提取 ..................................................... 引物序列 ....................................................................... PCR 扩增 ........................................................................ 电泳检测 ....................................................................... 检测结果判断 ................................................................... 1 2 2 2 2 3 6 结果判定 ........................................................................... 3 7 样品保存 ........................................................................... 3 8 档案保存 ........................................................................... 3 I DB37/T 3630—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省植物保护总站、山东农业大学。 本标准主要起草人：于金凤、刘存辉、商明清、孙晓凤、杨勤民、金扬秀、李洪刚、张德满、张莉、 谢传峰、徐鲁、成文华。 II DB37/T 3630—2019 小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法 1 范围 本标准规定了小麦普通腥黑穗病菌的分子检测方法。 本标准适用于小麦普通腥黑穗病菌的分子检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 小麦普通腥黑穗病菌 Tilletia foetida & Tilletia caries 指引起小麦普通腥黑穗病的病原菌统称，包括小麦光腥黑穗病菌（Tilletia foetida）和小麦网腥黑穗 病菌（Tilletia caries）两种。 2.2 小麦普通腥黑穗病菌分子检测 Molecular detection of Tilletia foetida & Tilletia caries 指依据小麦光腥黑穗病菌（Tilletia foetida）和网腥黑穗病菌（Tilletia caries）的ITS序列，设计特异 性引物，经PCR扩增获得特异性片段，依据特异性片段的有无进行判断检测。 3 仪器设备 摇床、显微镜、普通离心机、电热恒温水浴锅、移液器、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像 系统、锥形瓶、离心管、盖玻片、载玻片、电子天平等。 4 主要试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯。 CTAB缓冲液、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、TE 缓冲液、PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、DNA marker、1×TAE 缓冲液、琼脂糖、DNA Loading 缓冲液、溴化乙锭、3 mol/L NaOH 溶液、 1 mol/L HCl 溶液等。 5 分子检测 5.1 小麦种子中小麦普通腥黑穗病菌冬孢子基因组 DNA 提取 5.1.1 称取 50 g 小麦种子放入 250 mL 锥形瓶中，加入 100 mL 无菌去离子水，试验重复 3 次。 5.1.2 摇床 200 rpm 振荡 5 min 后，静置 10 min。收集洗涤悬浮液于 100 mL 离心管，8 000 rpm 离心 10 min，弃上清，留沉淀。 1 DB37/T 3630—2019 5.1.3 加入 1.5 mL 无菌水，充分混匀，转至 2 mL 离心管中，10 000 rpm 离心 5 min，弃上清。 5.1.4 用 1 mL 无菌水冲洗 100 mL 离心管 2 次，洗涤液一并转移至 2 mL 离心管，10 000 rpm 离心 2 min， 弃上清。 5.1.5 加入 1 mL 浓度为 3 mol/L 的 NaOH 溶液，65 ℃恒温水浴 30 min。取出离心管，用 1 mol/L HCl 溶液 中和，10 000 rpm 离心 2 min，吸出上清液，加无菌水冲洗沉淀 4 次，离心，吸出上清液。 5.1.6 向离心管内加入 700 μ L 预热至 65 ℃的 CTAB 缓冲液，65 ℃水浴 1 h，每隔 15 min 颠倒混匀 1 次。 5.1.7 待冷却至室温，加入等体积的 Tris 饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），充分混匀，抽提 2 次～3 次。 5.1.8 10 000 rpm 离心 10 min，将上清液转移至新的 2 ml 离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶ 1），充分混匀，抽提 2 次～3 次。 5.1.9 10 000 rpm 离心 10 min，吸取上清液至 1.5 mL 离心管中，加入等体积预冷至-20 ℃的异丙醇， 轻轻颠倒混匀，室温放置 30 min。 5.1.10 12 000 rpm 离心 15 min，弃上清液，留沉淀。 5.1.11 加入 1 mL 70 %乙醇冲洗管底的沉淀，12 000 rpm 离心 5 min，弃上清液，重复 2 次。 5.1.12 12 000 rpm 离心 30 s，去除残余的乙醇。 5.1.13 置于超净操作台内干燥约 15 min。 5.1.14 加入 30～50 μ L TE 缓冲液溶解 DNA。 注：也可采用经验证等效的该DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取。 5.2 菌瘿中冬孢子基因组 DNA 提取 取小麦病穗中的菌瘿，用镊子压破，释放并收集里面的冬孢子，转至2 mL离心管，采用CTAB法（详 见5.1.5～5.1.14）提取冬孢子基因组DNA。 5.3 引物序列 所用引物序列如下： XHS-F：5’-CTTTATTGCCGTACTTCTCTTCG-3’ XHS-R：5’-GCAACCTTCTCTTTCAAAAAG-3’ 预期的扩增片段大小为409 bp。 5.4 PCR 扩增 反应体系（25 µL）：无菌ddH2O 18 µL，10×PCR 缓冲液r 2.5 µL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 µL， 引物（20 μ mol/L）各0.5 µL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μ L）0.5 µL，模板DNA 1 µL。 反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环； 72 ℃延伸5 min。 5.5 电泳检测 每个样品取5 µL的PCR产物与1 µL的6 ×上样缓冲液混合均匀，加到1.2 %琼脂糖凝胶的点样孔中， 在120 V电压下下进行电泳，预期的扩增片段大小为409 bp（图1）。电泳结束后，在溴化乙锭溶液中浸 泡10 min，并在凝胶成像系统中观察、拍照记录检测结果。 2 DB37/T 3630—2019 注：M：DNA marker DL2000；1：小麦腥黑穗病菌的特异性片段；2：阴性对照。 图1 小麦普通腥黑穗病菌的 PCR 扩增 5.6 检测结果判断 在阳性、阴性及空白对照均反应正常的情况下，样品所有重复中只要有1个重复扩增后，电泳检测 出现409 bp（如图1）的特异性条带，则判定所检测样品结果为疑似阳性，该样品需要再重复进行一次 检测验证；如果样品所有重复扩增后，电泳检测均无特异性条带出现，则判定所检测样品结果为阴性。 6 结果判定 样品经PCR检测确定为阳性的，即判定为该样品带有小麦普通腥黑穗病菌。 7 样品保存 检测样品（应标明：样品编号、名称、来源以及取样地点、时间、样品数量、取样人、检测人等信 息）经登记后，按产地、来源、类别、品种等分别存放，置于低温干燥、防虫防鼠处妥善保存至少3个 月。如发现带有小麦普通腥黑穗病菌，该批样品应至少保存1年，以备查验。保存期满后，经灭菌处理 后销毁。 8 档案保存 收集整理小麦普通腥黑穗病菌检测过程中的各类信息、资料、照片等，建立档案，妥善保存。 _________________________________ 3