ICS 11.020 C 05 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 396.9—2017 代替 DB22/T 396-2014 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试 验 Toxicological evaluation procedures and test methods for health care products Part 9:Chromosome aberration test of cultured mammalian cells 2017 - 11 - 10 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 396.9—2017 前 言 DB22/T 396《保健用品毒理学评价程序与检验方法》拟分为如下部分： ——第 1 部分：评价程序； ——第 2 部分：急性经皮毒性试验； ——第 3 部分：长期经皮毒性试验； ——第 4 部分：皮肤刺激性试验； ——第 5 部分：皮肤变态反应试验； ——第 6 部分：细菌回复突变试验； ——第 7 部分：啮齿动物微核试验； ——第 8 部分：小鼠精子畸形试验； ——第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试验； ——第 10 部分：致畸试验； ——第 11 部分：致癌试验； ——第 12 部分：人体皮肤斑贴试验。 本部分为DB22/T 396-2017的第9部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本部分代替DB22/T 396-2014《保健用品毒理学评价程序与检验方法》，与DB22/T 396-2014相比， 结构做了较大调整。除编辑性修改外，主要技术变化如下： ——增加了警示； ——增加了范围； ——修改了标本制作； ——修改了镜检； ——修改了结果评价。 本部分由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。 本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：孟令仪、宋昕恬、张晶莹、吴晓刚、孙兰、隋自洁、高峰。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： ——DB22/T 396-2004； ——DB22/T 396-2014。 I DB22/T 396.9—2017 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 9 部分：哺乳动物培养细胞 染色体畸变试验 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品毒理学哺乳动物培养细胞染色体畸变试验评价程序。 本标准适用于保健用品毒理学哺乳动物培养细胞染色体畸变试验检验方法。 2 哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 2.1 细胞 哺乳动物原代或传代培养细胞。建议首选中国仓鼠肺细胞（CHL）。 2.2 剂量 至少用三种不同剂量进行测试。一般以50 %细胞生长抑制浓度（ID50）为测试的最高剂量。为此， 在测试之前，应测定受试物对培养细胞ID50，以受试物作用24 h为准。对于无细胞毒性的化合物，最高 浓度应是5 μl/ml,5 mg/ml或0.01mol/L，用倍量稀释法确定中、低剂量。 2.3 代谢活化 应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微粒体酶（S9），进行体外代谢活化试验，即在加S9mix和不加S9mix 平行的条件下测试。 2.4 受试物作用时间 受试物和细胞需接触适当时间后进行观察。非活化一般在接触24 h和48 h后收获细胞，代谢活化作 用6 h以上。 2.5 对照组设置 a) b) c) d) 2.6 2.6.1 空白对照：即受试物浓度为 0 的对照； 溶剂对照：生理盐水或受试物的溶剂对照； 阳性对照：可采用环磷酰胺、丝裂霉素等已知染色体畸变试验阳性的化合物； S9mix 对照作对照。 标本制作 消化 1 DB22/T 396.9—2017 用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶 的作用，混匀，放入离心管以800 r/min～1000 r/min的速度离心5 min，弃去上清液。 2.6.2 低渗 加入0.075 mol/L氯化钾溶液2 ml,用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37 ℃细胞培养箱中低渗处理30 min～40 min。 2.6.3 固定 加入2 ml固定液，混匀后固定5 min，以800 r/min～1000 r/min的速度离心5 min，弃去上清液。 重复一次，弃去上清液。 2.6.4 滴片 加入数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。玻片使用前用冰水浸泡。 2.6.5 染色 5%～10%姬姆萨染色，15 min～20 min。 2.7 镜检 每种浓度至少观察100 个分散良好的中期分裂相（染色体数2n+2）进行染色体畸变分析，在油镜下 观察染色体畸变数和畸变类型，在分析时应记录每一观察细胞的染色体数目，按受试物不同浓度、对照， 以及不同作用时间，列表表示，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。 2.8 2.8.1 2.8.2 结果评价 受试物引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并与剂量相关。 受试物在任何一个剂量条件下，引起的染色体机构畸变数增加具有统计学意义，并有可重复性。 _________________________________ 2