ICS 65.020.01 B 16 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2478—2018 植物检疫实验室常规检验技术 2018 - 04 - 18 发布 四川省质量技术监督局 病毒 2018 - 05 - 01 实施 发 布 DB51/T 2478—2018 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 原理 .............................................................................. 1 4 试剂与材料 ........................................................................ 1 5 仪器与用具 ........................................................................ 2 6 取样及送样 ........................................................................ 3 7 检测方法 .......................................................................... 3 8 结果判定 .......................................................................... 3 9 样品保存 .......................................................................... 3 附录A（资料性附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒主要症状特征 .................................. 4 附录B（资料性附录） 李属坏死环斑病毒主要症状特征 .................................... 5 附录C（资料性附录） 烟草环斑病毒主要症状特征 ........................................ 6 附录D（规范性附录） 酶联免疫吸附测定法检验程序 ...................................... 7 附录E（规范性附录） RT-PCR检验程序 .................................................. 9 I DB51/T 2478—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A、B、C为规范性附录，附录D、E为规范性附录，。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。 本标准起草人：万佳、宁红、邓亚岷、李刚、蒋辉、吴志平、郭迪金、李小松。 II DB51/T 2478—2018 植物检疫实验室常规检验技术 病毒 1 范围 本标准规定了植物检疫实验室病毒检验的原理、试剂与材料、仪器与用具、取样及送样、检测方法、 结果判定和样品保存。 本标准适用于植物检疫实验室病毒的检验和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 15569 农业植物调运检疫规程 3 原理 病毒病一般根据病害症状很难确定病毒种类，采用免疫学和分子生物学方法，可快速根据有关判断 标准进行检验鉴定。 4 4.1 试剂与材料 DAS－ELISA 血清学检验试剂 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 a) 包被抗体：病毒抗体稀释度按市售产品要求进行。贮藏于 4 ℃备用； b) 酶标抗体：用碱性磷酸酶标记的病毒免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 ℃ 冰箱保存备用； c) 包被缓冲液：取 2.93 g 碳酸氢钠（NaHCO3）、1.59 g 碳酸钠（Na2CO3），用 1000 ml 蒸馏水 溶解，pH 值为 9.6，贮藏于 4 ℃冰箱保存备用； d) PBST 洗涤液：取 1.15 g 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2 g 氯化钾（KCl）、0.2 g 无水磷 酸二氢钾（KH2PO4）、8.0 g 氯化钠（NaCl）、0.5 ml 吐温-20 ，用 1000 ml 蒸馏水溶解，pH 值为 7.2； e) 样品提取缓冲液：取 20 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、2.0 g 蛋清蛋白、1.3 g 无水亚硫酸钠 （Na2SO3）、0.2 g 叠氮化钠（NaN3）、0.5 ml 吐温－20、8 g 氯化钠、0.2 g 磷酸二氢钠、 1.15 g 磷酸氢二钠、0.2 g 氯化钾，用 1000 ml 蒸馏水溶解，贮藏于 4 ℃冰箱保存备用；。 f) 共轭物缓冲液：取 0.2 g 牛血清白蛋白，用 100ml PBST 缓冲液溶解，贮藏于 4 ℃冰箱保存备 用； g) 底物：对硝基苯磷酸二钠； h) 底物缓冲液：取 0.1 g 氯化镁（MgCl2）、90.39 g 二己醇胺（CH2CH2OH）、19.82 g 二己醇胺 -HCl（CH2CH2OH-HCl），用 1000 ml 蒸馏水溶解，pH 值为 9.8，贮藏于 4℃冰箱保存备用； 1 DB51/T 2478—2018 i) 4.2 终止液：12 g 氢氧化钠（NaOH）溶于 100 ml 蒸馏水。 RT-PCR 检验试剂 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 a) 莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶： 100 U/µl； b) 1× TAE 缓冲液：40 mM Tris-HCl， 20 mM NaAc， 2 mM EDTA(用冰醋酸调 pH 至 8.0)。 c) 5× RT 缓冲液：50 mM Tis-HCl pH7.5， 100 mM NaCl， 0.1 mM EDTA， 10 mM DTT， 0.01% NP-40，50%甘油； d) 10× PCR 缓冲液： 100 mM Tris-HCl (pH 8.3)， 500 mM KCl； e) MgCl2 25 mM； f) RNA 酶抑制剂： 10 U/µl； g) RT 增强剂； h) 无水乙醇（CH3CH2OH）； i) RL 裂解液； j) 去蛋白液； k) Taq 酶 2.5 U/µl； l) dNTP Mixture 10 mM； m) 双蒸水（ddH2O）； n) 2-巯基乙醇（C2H6OS）； o) 液氮 （N2）； p) 相应病毒引物； q) 100 bp DNA ladder (≤1500 bp)； r) 溴酚蓝（C19H10Br4O5S）； s) 琼脂糖凝胶：称取 1.5 g 琼脂糖缓缓倒入 250 ml 三角瓶内，加入 100 ml 1×TAE，在微波炉 中加热 1 min 溶解后，再加入 5 µl Goldview 的生物染料，倒入调平并安放适当梳齿的制胶 板上，冷凝后小心拔出梳齿。 5 仪器与用具 主要仪器及用具包括： a) 聚乙烯微量滴定板 根据样品数量选用 48 孔和 96 孔两种规格。 b) 移液器 2 µl～10 µl、10 µl～50 µl、10 µl～200 µl、200 µl～1000 µl 和 1 ml～5 ml 五 种规格及配套吸头。 c) 电子天平 1/100 g，1/1000 g。 d) 恒温培养箱。 e) 台式高速离心机。 f) 酶联免疫检测仪。 g) 水平电泳仪。 h) 凝胶成像系统。 i) PCR 扩增仪。 j) 研钵 内径 60 mm～80 mm。 k) 冰箱、超低温冰箱。 2 DB51/T 2478—2018 6 6.1 取样及送样 取样 调运检疫样品按照 GB 15569 中附录D和附录E相关规定进行取样，产地检疫样品按照相应的检疫 性有害生物产地检疫技术规程规定的取样要求进行取样，疫情监测样品按照相应的检疫性有害生物监测 防控技术取样要求进行取样。 6.2 送样 在调运检疫、产地检疫及疫情监测过程中，采集具有可疑症状的叶片、枝条、果实、种子等材料， 用纸袋包装，并注明采样地点、品种、GPS、采样人、采样时间等，在保证不腐烂的前提下及时送检。 7 7.1 检测方法 症状观察 观察样品有无异样，初步判断是否具有病毒的表现特征（见附录A、B、C）。 7.2 DAS－ELISA 血清学检验 检验方法见附录D。如采用认可的试剂盒，按说明操作。 7.3 RT-PCR 检验 检验方法见附录E。如采用认可的试剂盒，按说明操作。 8 8.1 结果判定 DAS－ELISA 在阴性对照OD值≤0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照 OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带相应的被检病毒；否则判定为阴性反应，即样品不带相应的被 检病毒。 8.2 RT-PCR 在阴性对照、空白对照无扩增条带，且阳性对照出现被检病毒目标条带的前提下，样品RT-PCR产物 电泳结果与被检病毒目标条带长度一致，判定为阳性反应，即样品带被检病毒；否则判定为阴性反应， 即样品不带被检病毒。 9 样品保存 经检疫鉴定后的样品，应在-80 ℃～-20 ℃冰箱保存三个月，以备复验、谈判和仲裁，保存期满后， 需进行灭活处理。 3 DB51/T 2478—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒主要症状特征 A.1 危害与症状 该病毒主要危害黄瓜、西瓜、南瓜和甜瓜等葫芦科作物。一般造成减产20%以上，严重的甚至绝收。 在西瓜叶片只产生轻微的斑纹和矮化，但在果实中却造成严重的变色或使果实内部造成腐烂，在黄瓜叶 片上出现色斑，水泡及变形，植株矮化，病株开花迟、少花，不结果或果畸