ICS 67.050 B 31 天 DB12 津 市 地 方 标 准 DB12/T 648—2016 黄瓜品种纯度 SSR 分子标记检测方法 Methods of identifying varietal purity of cucumber by using SSR-based markers 2016-09-27 发布 2016-11-01 实施 天津市市场和质量监督管理委员会发布 DB12/T 648—2016 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由天津市农村工作委员会提出。 本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心。 本标准主要起草人：兰青阔、张桂华、王惠哲、赵新、王成、崔兴华、朱珠、陈锐、徐石勇。 本标准 2016 年 9 月首次发布。 I DB12/T 648—2016 黄瓜品种纯度 SSR 分子标记检测方法 1 范围 本标准规定了黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法的术语和定义、检测方法、纯度计算方法。 本标准适用于黄瓜单交种的纯度检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 2474 黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种纯度 Varieties Purity 品种纯度指种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占 检测样品种子粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。 3.2 聚合酶链式反应 PCR（Polymerase Chain Reaction） 一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。 3.3 简单重复序列 SSR（Simple Sequence Repeat） 由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp）的串 联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 3.4 分子标记 Molecular Marker 以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生物在遗传上的差异。 4 原理 1 DB12/T 648—2016 SSR分布于黄瓜整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR 技术将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行黄瓜品种纯度检测。 5 仪器设备及试剂 5.1 仪器设备 PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000 V，400 mA，400 W）；万分之一电子天 平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌 锅；pH计等。 5.2 试剂 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基 硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青 FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）； 过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；Taq DNA聚合酶（含Mg2+的10×PCR缓冲液）；四 种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；Gold View染料；实验用水为重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。 5.3 溶液配制 相关溶液配制方法见附录A。 6 方法步骤 6.1 取样 按照GB/T 3543.2规定方法扦样，从送检样品中随机取10 g种子，分别随机取其亲本种子10粒。 6.2 单粒种子的 DNA 提取 6.2.1 样品预处理 在玻璃培养皿底部垫上一层厚度适宜的棉花，用自来水浸湿后均匀地撒上种子，再于表面覆盖一 层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16小时28℃光照培养，8小时22℃暗培养，待种子长出子叶后 备用。也可采用经验证的、等效的培养条件。 6.2.2 DNA 提取 取单株幼苗子叶，放入1.5 mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5 mL离心管中。将DNA提取液预 热到65℃，每管放入400 µL混合样品，将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温30 min后取下，向 离心管中加入400 µL 24:1氯仿-异戊醇（V:V），振荡混匀。10 000 g离心10 min。将上清液200 µL转入 另一支1.5 mL离心管，加入400 µL -20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10 000 g离心1 min，弃上清液，加入 500 µL乙醇—乙酸铵溶液，6000 g离心5 min收集沉淀。加入100 µL TE（pH8.0）溶液溶解DNA。用0.8 % 的琼脂糖凝胶电泳检测DNA。使用紫外-可见成像系统观察DNA电泳条带的完整性。 6.3 分子标记筛选 2 DB12/T 648—2016 用35对核心引物（见附录B，部分引用NY/T 2474）进行PCR反应，扩增双亲及送检样品各10份DNA， 筛选带型清晰，双亲间差异大，互补性好的引物作为纯度检测的SSR分子标记。 6.4 PCR 扩增 6.4.1 反应体系 总体积20 μL，包括9.2 μL超纯水、2 μL含Mg2+的10×PCR缓冲液、1.6 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、 3.2 μL SSR引物（10 μmol/L）、2 μL Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）、2 μL DNA（30~50 ng/μL），混匀。 6.4.2 反应程序 94℃预变性4 min；94℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃延伸5 min；4℃ 保存。 6.5 变性聚丙烯酰氨凝胶电泳 按照附录C规定的方法，进行4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩增产物。 7 纯度计算 以筛选出来的SSR分子标记为引物扩增至少100份送检样品的DNA，通过带型统计，用具有本品种 特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下： 纯度%  具有本品种特异带型的 种子粒数  100% 检测样品种子粒数 3 DB12/T 648—2016 附录A （规范性附录） 溶液配制 A.1 DNA提取液 含有200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），250 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，0.5% SDS，经高压蒸 汽灭菌后使用。 A.2 引物稀释 按照引物合成单的说明先配制100 μmol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2.5 mmol/L的使用液。 A.3 6×变性上样缓冲液 去离子甲酰胺49 mL，0.5 mol/L的EDTA溶液（pH 8.0）1mL，溴酚蓝0.125 g，二甲苯青0.125 g。 A.4 10×电泳缓冲液 Tris 108g，硼酸55 g，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液37 mL，定容至1000 mL。 A.5 40%丙烯胺胶 丙烯酰胺190 g，甲叉双丙烯酰胺10 g，定容至500 mL。 A.6 4.5%丙烯胺胶 尿素450 g，10×电泳缓冲液100 mL，40%丙烯酰胺胶112.5 mL，定容至1000 mL。 A.7 1%亲和硅烷 20 μL亲和硅烷，20 μL冰醋酸，加无水乙醇至2 mL。现用现配。 A.8 2%剥离硅烷 1 mL剥离硅烷，49 mL三氯甲烷。 A.9 10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵溶于1 mL超纯水中。现用现配。 A.10 固定液 4 DB12/T 648—2016 200 mL冰醋酸，定容至2000 mL。 A.11 染色液 4 g硝酸银，定容至2000 mL。 A.12 显影液 2000 mL蒸馏水中加入40 g氢氧化钠和10 mL甲醛。 5 DB12/T 648—2016 附 录 B （规范性附录） 41 对核心引物 序号 名称 序列(5’-3’) 01 SSRTJ001 02 SSRTJ002 03 SSRTJ003 04 SSRTJ004 05 SSRTJ005 06 SSRTJ006 07 SSR00262 F:CCGTTGGTCTTGGACTCTCA R:TGTAAAAGTGATCAGGAGGGTCT 08 SSR16695 F:CACAATCCCACGAAGAACAA R:TGCAATTATGGCAAATCAAAA 09 SSR10839 F:TTGAATTCCTCTGCCCAATC R:TGGAATTTTGTTAGGGGGAA 10 SSR05723 F:TGGCTTTTCTGTCACGTCC R:TCCATGGTACAACAAGAATCACA 11 SSR17922 F:CATTCTAGGTCAATGAATCGCA R:GCAAAGTTGCCACATTGAAG 12 SSR03070 F:GCTAACACTACCCGCTGCTT R:AACAGAAAGAGAATCGGGGG 13 SSR05748 F:TGTGGCCTGTGCTAAAATGA R:TTTGGAAAAGCTAAAGCCCA 14 SSR23220 F:GTTTGCATGAAAATGGGGAT R:CATCATCTTCTTGGTGGTTCC 15 SSR20079 F:ATCAGCATGTGGTGTGGTGT R:GGGATATGCGTTTGCATTTA 16 SSR10518 F:TCTAATTCGCTCCGGATGAT R:TTGCAGCGAACAATCCTGTA 17 SSR04530 F:CCTCTAGACTGAAAAAGAGGGACA R:ATTATTTGGGCCTTTGGGAA 18 SSR07131 F:TTCTCATGCTTCCTACCGCT R:TTCTATTGGAGGGCTGGTTG F:TCGCCCACGTCCTCTATATC R:GCTAATGAAGGGGGAGGAGA F:GCGTTAAAATTCCCAACGG R:GGAGAGAAATTGGAATTCGGCAG F:GGGTCTAATATTTGGGGATGG R:GGTTGTTCTTGTGGAATGTG F:TACACCTCTGCGAAGCACC R:GTTTCGCACTCACTCTTTACCG F:TTTAATGGCGTCGAAAT