YBB000120032015 细胞毒性检查法 XibaoDuxing Jianchafa TestforCytotoxicity 本法是将一定量的供试品溶液加入细胞培养液中，培养细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观 察，评价供试品对体外细胞的潜在毒性作用。 试验用细胞推荐使用小鼠成纤维细胞（L-929)。试验时采用传代48～72小时生长旺盛的细胞。 试验前的准备 与样品及细胞接触的所有器具均需无菌（必要时可采用湿热灭菌如115℃保持30分 钟；干热灭菌如250℃保持30分钟或用180℃保持2小时）。 细胞悬液的制备对已培养48～72小时生长旺盛的细胞消化混匀进行计数，将其配制成4×104个/ml 的细胞悬液。 供试品溶液的制备 将供试品用适宜的清洁剂清洗除去油污，再用纯化水冲洗干净，滤纸吸干后切成 0.5cm×2cm条状，用湿热灭菌或紫外线照射消毒后，置玻璃容器内。除另有规定外，按表1加入氯化钠注 射液或无血清培养基作为浸提液，使浸提液浸没供试品，按表2选择浸提条件（若采用含血清培养基，应 用37℃土1℃、24小时土2小时的条件）浸提，即得。 表1 供试品表面积或重量与浸提液的比例 供试品厚度（mm） 表面积或重量与浸提液体积的比例 0 6 cm²/ml >0.5~1.0 3 cm²/ml >1.0 1.25 cmz/ml 不规则形状 0.2 g/ml 表2浸提条件 浸提温度（℃） 浸提时间（小时） 37±1 24±2 37±1 72±2 50±2 72±2 70±2 24±2 第一法 相对增殖度法 阴性对照液为不加供试品的细胞培养液。 阳性对照液6.3%苯酚的细胞培养液 检查法取33个培养瓶，分别加入细胞悬液1ml，细胞培养液4ml，置37℃土2℃，5%二氧化碳的 条件下培养24小时。培养24小时后弃去原培养液。 阴性对照组：取13个培养瓶加入5ml阴性对照液；阳性对照组：取10个培养瓶加入5ml阳性对照 液；试验组：取10个培养瓶加入5ml含50%供试品溶液的细胞培养液，置37℃土2℃，5%二氧化碳的条 ·330· 第七部分方法类药包材标准 件下继续培养7天。 细胞形态学观察和计数：在更换细胞培养液的当天，取3瓶阴性对照组，并在更换后第2、4、7天， 每组各取3瓶进行细胞形态观察和细胞计数。 毒性评定：细胞形态分析标准按表3规定。 表3 细胞形态分析表 反应程度 细胞形态 无毒 细胞形态正常，贴壁生长良好，细胞呈棱形或不规则三角形 轻微毒 细胞贴壁生长好，但可见少数细胞圆缩，偶见悬浮死细胞 中度毒 细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩较多，达1/3以上，见悬浮死细胞 严重毒 细胞基本不贴壁，90%以上呈悬浮死细胞 细胞相对增殖度分级标准按表4规定。 表 4 细胞相对增殖度分级表 分级 相对增殖度 0 ≥100 1 75~99 2 50~74 3 25~49 4 1~24 5 0 根据各组细胞浓度按下式计算细胞相对增殖度（RGR)： 供试品组（或阳性对照组）细胞浓度平均值 RGR= ×100% 阴性对照组细胞浓度平均值 结果评价试验组相对增殖度（以第7天的细胞浓度计算）为0级或1级判为合格。试验组相对增殖 度为2级，应结合形态综合评价，轻微毒或无毒的判为合格。试验组相对增殖度为3～5级判为不合格。 第二法琼脂扩散法 本法适用于弹性体细胞毒性的测定。当聚合物样品中可滤取的化学物质扩散时，琼脂层可起到隔垫的 作用保护细胞免受机械损伤。材料中的提取物将通过一张滤纸被进行试验。 阴性对照制备取高密度聚乙烯参比物质，照供试品溶液制备项下的规定进行。 阳性对照制备取生物毒性阳性参比物质，照供试品溶液制备项下的规定进行。 检查法取细胞悬浮液7ml，置直径60mm的平血中培养单层细胞。培养后，吸去培养基，替换为添 加琼脂不少于2%的含血清培养基（注：琼脂的量必需适应细胞生长。琼脂层必需足够薄以利于滤取的化 学物质的扩散）。 将供试品溶液、阴性对照、阳性对照或它们在合适的浸提介质中的提取物放置在固化的琼脂表面， 平行试验2份。每个平皿中的样品不超过3个。37℃土2℃培养至少24小时，最好选用增湿的培养 箱，含二氧化碳浓度为5%。在显微镜下观查每个样品、阴性对照、阳性对照周围的培养基，如有必要， 进行染色。 结果评价 生物毒性（细胞退化和畸变）按0～4级（表5）评价和分级。记录样品、阴性、阳性细胞 培养基的现象。如阴性对照为0级（无毒）、阳性对照不小于3级（中等毒），则细胞培养基试验系统有效。 · 331 ·