ICS 65.020.30 B 43 T/ZNZ 浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准 T /ZNZ 044—2020 畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法 Method for antibacterial resistance surveillance in livestock a nd poultry breeding 2020 - 12 - 08发布 2021 - 01 - 08实施 浙江省农产品质量安全学会 发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 044—2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规则起 草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不 承担识别专利的责任 。 本文件由浙江省农产品质量安全学会 提出并归口。 本文件起草单位： 浙江省农业科学院农产品质量 安全与营养 研究所。 本文件主要起草人： 杨华、唐标、王小骊 、钱鸣蓉、吉小凤、吕文涛、肖英平、汪建妹 、谈思敏、 吴静、汪雯、肖兴宁 、吴俐勤、李锐。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 044—2020 1 畜禽养殖环节 细菌耐药性监测 方法 1 范围 本文件规定了畜禽养殖 环节细菌耐药性监测的设备和材料、试剂 和培养基、样品采集与 保存、细菌 分离鉴定与保存、抗菌药物敏感性试验、 生物安全的要求。 本文件适用于畜禽 源的大肠埃希 氏菌、肠球菌和弯曲 杆菌分离鉴定 ，及其抗菌 药物敏感性试验（ 微 量肉汤稀释法 ）。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789. 4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.9 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 4789.3 8 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 2206.5 化妆品微生物检验方法第 5部分：肠球菌 YY/T 1169 麦康凯琼脂培养基 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细菌耐药性 antibacterial resistance 细菌耐药性是指细菌对抗菌药物不敏感的现象。 3.2 抗菌药物敏感性试验 antibacterial susceptibility testing 用于测试抗菌药物在体外对细菌有无抑制或杀灭作用的标准 化试验，简称药敏试验。 3.3 最低抑菌浓度 minimal inhibitory concentration ，MIC 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 044—2020 2 体外能够抑制肉眼可见 的细菌生长的最低药物浓度。 3.4 折点 breakpoint 用于判定测试菌株敏感 （Susceptible ）、中敏（Intermediate ，I）和耐药（Resistant，R）的最低抑菌 浓度。 4 设备和材料 开展细菌耐药性监测微生物实验室应符合 GB 19489 生物安全二级实验室（ BSL-2）要求，灭菌、 培养和鉴定设备按 GB 4789.1 和GB 4789.9 执行，其他设备如下： ——微量移液器： 0.1 μL～2.5 μL；0.5 μL～10 μL；10 μL～100 μL；100 μL～1 000 μL； ——电子天平：感量 0.01 g，感量 0.00 001 g ； ——自动加样仪或多通道微量加样器： 1 μL～100 μL； ——厌氧培养罐； ——麦氏比浊管和浊度仪：可测量范围麦氏浊度 0.01～4.00； ——核酸电泳仪； ——凝胶成像系统； —— PCR扩增仪； ——质谱鉴定仪 ：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪， 含常见病原菌数据库。 5 试剂和培养基 5.1 实验用水 实验用水应符合 GB/T 6682 和GB 4789.28的规定。 5.2 无菌生理盐水 称取 0.9 g氯化钠溶于 100 mL蒸馏水中， 121℃灭菌 15 min。 5.3 抗菌药物 抗菌药物贮备液和工作液的制备与保存见附录 A。 5.4 培养基 5.4.1 运送培养基的制备按 GB 4789.28 执行。 5.4.2 缓冲蛋白胨水的制备按 GB4789.4 执行。 5.4.3 大肠埃希氏菌显色培养基 (伊红美蓝琼脂培养基 )的制备按GB 4789.38 执行。 5.4.4 大肠埃希氏菌 显色培养基 (麦康凯琼脂培养基 )的制备按YY/T 1169 执行。 5.4.5 肠球菌显色培养基的制备按 SN/T 2206.5 执行。 5.4.6 LB琼脂培养基的制 备按附录 B.1执行。 5.4.7 Bolton肉汤（ Bolton broth ）的制备按 GB 4789.9 执行。 5.4.8 改良 CCDA琼脂的制备按 GB 4789.9 执行。 5.4.9 哥伦比亚血平板的制备按 GB 4789.9 执行。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 044—2020 3 5.4.10 布氏肉汤的制备按 GB 4789.9 执行。 5.4.11 弯曲杆菌保藏液的制备按附录 B.2执行。 5.4.12 MH肉汤（ Mueller -Hinton broth ）的制备按附录 B.3执行。 5.5 质控菌株 5.5.1 大肠埃希 氏菌（ Escherichia coli ，ATCC 25922 ）； 5.5.2 粪肠球菌 ATCC 29212 （Enterococcus faecalis ，ATCC 29212 ）； 5.5.3 空肠弯曲杆菌 ATCC 33560 （Campylobacter jejuni ，ATCC 33560 ）。 注：质控菌株在 -70 ℃以下保存 ，传代不应超过5次。 6 样品采集与保存 6.1 样品采集 6.1.1 直肠/泄殖腔拭子采集 用无菌生理盐水或运送培养基浸润灭菌棉拭子，伸入家畜直肠或家禽泄殖腔 1.5 cm～2.0 cm，旋转 2圈～ 3圈，立即将棉拭子置于 10 mL运送培养基中。 6.1.2 新鲜粪便采集 用灭菌棉拭子蘸取新鲜粪便，不应沾有泥土或其他污染物， 立即将棉拭子及样品置 于10 mL运送 培养基中。对用于弯曲杆菌分离的样品，应采集成团或成堆的新鲜粪便样本。 6.1.3 盲肠内容物采集 用灭菌棉拭子蘸取盲肠内容物， 立即置于10 mL运送培养基中。对用于弯曲杆菌分离的样品，宜在 屠宰时截取一段内容物丰富的盲肠段，结扎后置于无菌密封袋。 6.2 采样记录和标识 样品采集后应加盖密封，并加注样品标识 ，及时填写采样记录表。采样记录表和样品编码格式 参见 附录C。 6.3 样品保存 样品应置于 2℃～8℃条件下保存，避免交叉污 染。对用于弯曲杆菌分离的样品 ，保存过程 应放置微 需氧产气袋，以提高分离率。 6.4 样品运输 采集的样品由专人 保管，按 GB 4789.1 要求运达检验单位 ，运输时间 不超过 48 h。运输工具应保持 清洁。运输和装卸过程中应防止包装破损，样品渗漏。 6.5 样品接收 实验室接收样品时，应确认样品完好情况、数量， 交接双方签字确 认。样品 应立即开展细菌分离。 7 细菌分离 鉴定与保存 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 044—2020 4 7.1 细菌分离 鉴定 7.1.1 大肠埃希氏菌分离 鉴定按附录 D.1执行。 7.1.2 肠球菌分离 鉴定按附录 D.2执行。 7.1.3 弯曲杆菌分离 鉴定按附录 D.3执行。 7.1.4 大肠埃希氏菌、肠球菌、弯曲杆菌 鉴定可参照附录 D.4执行。 7.2 分离菌株保存 分离菌株保存参照 GB 4789.28 执行。 8 抗菌药物敏感性试验 8.1 细菌培养 测试菌株和质控菌株在测试前应分别连续培养 2次以获得纯培养物，培养方法按 附录 D执行。 8.2 药敏板准备 准备 96孔透明无菌微孔板，每孔加样体积应超过 100 μL。用MH肉汤（弯曲杆菌 药敏试验另加 5%马 血清） 将抗菌药物贮备液稀释制备工作液， 系列倍比稀释至测试浓度， 测试浓度参考附录 A， 每孔 50 μL。 分别各设置 1个阴性对照孔和阳性对照孔。 使用商品化试剂盒时，按照试剂盒说明书进行操作。 8.3 菌悬液制备 挑取培养 12 h～24 h的单菌落 3个～5个，转移至含 2 mL～3 mL无菌生理盐水或 MH肉汤的试管 中混匀，用浊度仪 和标准比浊管校正菌液浓度至 0.5麦氏单位（ ≈1×108 CFU/mL） ，用 MH肉汤稀释 100 倍，混匀备用，调制好浓度的菌液应在 15 min内完成加样。 8.4 菌悬液接种 阴性对照孔中