ICS13.060 C51T/SDAQI 团 体 标 准 T/SDAQI007—2021 生产用水中铜绿假单胞菌的快速定性检测 实时荧光PCR方法 RapidqualitativedetectionofPseudomonasaeruginosainproductionwater Real-timePCRmethod 2021-09-25发布 2021-10-25实施 山东质量检验协会  发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SDAQI007—2021 I版权说明 本文件系由山东质量检验协会（简称“协会”）组织创制的团体标准文本（含制定过程中的草案）， 协会拥有本文件的著作权，受《中华人民共和国著作权法》保护。除法律所允许的情形或事先得到协会 书面许可外，任何组织和个人不得以任何理由进行复制、销售、传播本文件，或抄袭、歪曲本文件等侵 权行为，否则，行为人应承担相应的民事、行政责任，构成犯罪的，将依法追究其刑事责任。其他文件 引用本文件，不属侵权行为。 凡利用本文件进行或支持贸易、认证等商业活动，应事先购买正式文本或得到协会书面授权。购买 本文件或获得授权，请与协会联系。 欢迎社会各界举报侵权盗版行为，协会将依法严格保护举报人信息。 联系人：范红梅 联系电话：0531-8970198615668365153 联系邮箱：[email protected] 协会对本版权声明拥有最终解释权。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI007—2021 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东质量检验协会提出并归口。 本文件起草单位：山东省产品质量检验研究院、滨州市食品药品检验检测中心、南京诺唯赞生物科 技股份有限公司。 本文件主要起草人：王一村、李娜、李秀超、高静静、赵娟、周莉莉、才美佳、张宇鑫、赵彤彤、 田洪根、刘红、朱玉兰。 本文件的所有权和解释权归山东质量检验协会。 如果您在本文件使用中发现错误或技术内容有不当之处，请及时与协会秘书处联系，将意见发送到 [email protected]。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI007—2021 1生产用水中铜绿假单胞菌的快速定性检测实时荧光PCR法 1范围 本文件规定了与人、动物健康相关的诸如食品、饲料、饮用水等行业生产用水中铜绿假单胞菌的快 速定性检测方法。 本文件适用于生产用水中铜绿假单胞菌的快速定性检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 样品经抽滤设备过滤后，将过滤后的膜放入选择培养基中培养。收集培养后的菌液进行DNA提取。 以DNA为模板，采用细菌16SrDNA基因序列作为内参照，以铜绿假单胞菌中外毒素A（eta）基因中相 对保守且高度特异的引物和探针进行目标物的实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否含有铜绿 假单胞菌。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。 5仪器设备 5.1电子天平：感量0.01g。 5.2微量可调移液器。 5.3恒温水浴锅。 5.4磁力搅拌器。 5.5高速冷冻离心机：离心力12000g，4℃。 5.6二级生物安全柜。 5.7高压灭菌锅。 5.8普通冰箱：4℃，-20℃。 5.9pH计。 5.10核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI007—2021 25.11实时荧光定量PCR仪。 5.12抽滤设备。 5.13无菌滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μm。 5.14恒温培养箱：36℃±1℃。 6试剂或材料 试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T27403的规定执行。 除另有规定外，试剂应为分析纯或化学纯级别，实验用水应符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 6.1检测用引物和Taqman探针序列（详见表1） 表1检测用引物和Taqman探针 名称 序列（5'—3'） 目的基因 内参照5'端引物 内参照3'端引物 内参照探针F:5’-TTAAGTCCCGCAACGAGC-3’ R:5’-TTGTAGCACGTGTGTAGCCC-3’ P:5’-VIC-TTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC-TRAMA-3’细菌16SrRNA基因 检测用5'端引物 检测用3'端引物 检测用探针F:5'-AAGGTGTTCATCCACGAACTGA-3' R:5'-ATGGTGTAGATCGGCGACATG-3' P:5'-FAM-CCGGTAACCAGCTCAG-MGBNFQ-3’铜绿假单胞菌eta基因 6.2三氯甲烷。 6.3异戊醇。 6.4异丙醇。 6.5商品化2×荧光定量PCR预混液。 6.670%乙醇。 6.7蛋白酶K：20mg/μL。 6.8RNA酶溶液：5μg/μL。 6.9Tris饱和酚。 6.10TE冲液：10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。 6.11CTAB缓冲液：55mmol/LCTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris，调pH5 至8.0。121℃高压灭菌20min，备用。 6.12假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂：见附录A。 7样品 7.1水样过滤 在百级洁净的工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴 放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过 滤后的滤膜正向贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡，平行 做两份实验。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI007—2021 37.2培养 将平板倒置于36℃±1℃的培养箱中培养24h—48h，并防止干燥。 7.3菌体收集 用灭菌的1mL0.9％的生理盐水洗脱滤膜上的菌落，并将菌液收集于灭菌的2mL离心管中。重复洗 脱一次，将两次菌液合并后进行下一步检测。 8试验步骤 8.1DNA提取 将上述收集于灭菌的2mL离心管中的菌液6000g离心1min，弃上清。加入1000μLCTAB缓冲液和 40μL蛋白酶K，震荡混匀，65℃温浴30min，每隔10min振荡混匀。12000g离心10min，吸取1mL上 清液至2mL离心管中，勿吸取管内杂质。向离心管中加入500μL体积比为25：24：1的酚-三氯甲烷-异 戊醇的混合液（现用现配），剧烈震荡，12000g离心12min。吸取上清液至一新离心管中，加入等体 积异丙醇，剧烈震荡，12000g离心10min。弃上清液，用65℃预热的双蒸水溶解DNA。加入5μLRNA 酶，37℃温浴30min。加入200μL体积比为24：1的三氯甲烷-异戊醇混合液，剧烈震荡，12000g离心12 min。吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，震荡均匀，12000g离心10min。弃上清，70% 乙醇洗涤一次，12000g离心1min。弃上清液，晾干后加入50μLTE缓冲液溶解DNA，-20℃保存。 DNA提取也可使用等效的DNA提取试剂盒替代。 8.2DNA浓度及纯度的测定 取适量的DNA模板溶液加双蒸水稀释一定倍数后，使用紫外分光光度计测定260nm和280nm处的 吸光值A260和A280，DNA浓度计算按式（1）计算， C=A×N×50……………………………………………(1) 式中： C--------DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）； A--------260nm处的吸光值； N--------核酸稀释倍数； 50-------吸光值A260为1时，相对应双链DNA的浓度常数； 当A260/A280比值在1.8～2.0之间时，DNA模板适宜荧光定量PCR扩增。 若检测DNA模板浓度不在规定范围内，可适当增加样品采样量或增加荧光定量PCR反应过程中模 板量或减少溶解DNA的溶剂的量，提高浓度，以保证检测的有效性。 8.3实时荧光PCR检测 8.3.1实时荧光PCR反应体系 表2实时荧光PCR反应体系 试剂成分 体积（单位：μL） 2×荧光定量PCR预混液 12.5 引物F（10μM） 0.6 引物R（10μM） 0.6 探针P（5μM） 0.3 全国团体标准信息平台 T/SDAQI007—2021 4试剂成分 体积（单位：μL） 样品DNA（10ng/μL～100ng/μL） 1 ddH2O 补至25 8.3.2实时荧光PCR反应参数 95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火40s，45个循环。 8.3.3实验对照 检验过程中分别设内参照、阳性对照、阴性对照、空白对照。以荧光假单胞菌的DNA为内参照、 以铜绿假单胞菌标准菌株或构建的标准质粒DNA为阳性对照、以其他细菌的DNA为阴性对照，以灭菌 水为空白对照。所有反应均设置两个平行反应体系。 9质量控制 以下条件有一条不满足时，实验视为无效，需重新进行实验。 a)空白对照：无荧光对数增长