ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 30-2020 口蹄疫病毒 A型抗体化学发光免疫分析检 测方法 chemiluminescent immunoassay for detection of FMDV A virus antibody 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 30-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构 和起草规则》 的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的 责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心、 青海省动物疫病预防控制中心、 新疆维吾尔自治区 动物疫病预防控制中心、 洛阳现代生物技术研究院有限公司、 西藏自治区动物疫病预防控制中心、黑龙 江省动物疫病预防控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：孙雨、王传彬、 马英、宋晓晖、赵晓春、王睿男、李秀梅、杨林、蔡金山、刘 亚涛、阚威、黄辉、 姚强、王谢忠、孙航、顾小雪、 林汉亮、王文、 沈艳丽、赵全邦、 央珍、蒋菲、邹 联斌、韦正吉、 毕一鸣、刘颖昳、徐琦、胡冬梅、 刘近、吕园园、耿玉静、任雪建。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 30-2020 1 口蹄疫病毒 A型抗体化学发光免疫分析检测方法 1 范围 本文件规定了口蹄疫病毒 A型抗体的化学发光免疫分析检测方法 的试剂与材料、仪器与设备、技 术原理、实验前准备工作、操作步骤、试验成立标准、结果判定标准等内容 。 本文件适用于猪、牛、羊等动物血清中口蹄疫病毒 A型抗体的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适 用于本文件；不注日期的 引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂与材料 4.1 口蹄疫 VP1重组蛋白， 按照附录 A制备 4.2 口蹄疫 A型单克隆抗体， 按照附录 B制备 4.3 酶结合物， 按照附录 C制备 4.4 包被缓冲液， 按照附录 D.1配制 4.5 封闭液， 按照附录 D.2配制 4.6 酶结合物稀释液， 按照附录 D.3配制 4.7 样品稀释液， 按照附录 D.4配制 4.8 校准品稀释液， 按照附录 D.5配制 4.9 校准品 1~校准品 6，按照附录 D.6~D.7配制 4.10 25倍浓缩洗涤液， 按照附录 D.8配制 4.11 化学发光底物 A，按照附录 D.9配制 4.12 化学发光底物 B，按照附录 D.10配制 5 仪器与设备 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 30-2020 2 化学发光免疫分析仪 、分析天平 、洗板机、37 ℃温箱、2 ℃~8 ℃冰箱、﹣20 ℃冰箱、单道微量移 液器（ 0.5 µL~10 µL；10 µL~100 µL；20 µL~200 µL；100 µL~1000 µL）、多道移液器（ 300 µL）、NUNC 反应板、血清稀释板（96孔一次性 U型血凝板或 96孔细胞培养板 ）、一次性注射器（ 5 mL、10 mL）。 6 技术原理 采用竞争反应原理，包被板上包被 口蹄疫 VP1重组蛋白，待检样品中的特异性抗体和酶标记抗体竞 争性结合重组蛋白，待检样品中抗体剂量值与发光信号值成反比，通过校准曲线拟合计算，即可得出待 检样品中抗体的剂量。 7 实验前准备工作 7.1 样本采集及处理 采集静脉血时，每头猪、牛或羊使用一个注射器。进行静脉无菌采血，不少于 2 mL。倾斜放置于 室温中静置 2 h~4 h，待血液自然析出血清，必要时可低速离心（ 1000 g离心 10 min~15 min ），分离血 清，应符合 NY/T 541 的要求。 7.2 血清样本的 保存与运输 血清样本 若在一周 内检测，可置 2 ℃~8 ℃条件下保存 。若超过 一周检测，应置于 -20 ℃以下冷冻保 存。运输时注意冷藏，确保样品有效。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时 间应尽量缩短。 8 操作步骤 8.1 包被 将VP1重组蛋白用包被缓冲液稀释到 1.5 µ g/mL，以 100 µL/孔的量加入酶标板中，置 2 ℃~8 ℃包被 16 h。 8.2 洗板 弃去包被液， 将25倍浓缩洗涤液稀释成 1倍洗涤液，用 300 μL洗涤液洗涤板孔 ，洗板 2次。每次洗涤 后应弃去孔内的液体。最后一次 洗涤液弃去后， 将包被板 在吸水纸上拍干 ，直至孔内无残留洗涤液 。 8.3 封闭 每孔加入 150 µL封闭液，置于 37 ℃封闭 2 h。弃去封闭液，在吸水纸上拍干。 8.4 干燥 置于 37 ℃干燥 3 h~5 h。将包被板装入铝箔袋 ，加干燥剂，抽真空，置于 冰箱 2 ℃~8 ℃保存备用。 8.5 样品稀释 在血清稀释板中，用样品稀释液将待检样品按照 1﹕20比例进行稀释。例如： 3 µL样品加 57 µL样品 稀释液。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 30-2020 3 8.6 加样 取出包被板。 每次实验需设置系列校准品 6孔。 首先在血清稀释板上依次加入校准品 1~6各60 µL， 其余各孔依次加入待检 样品各 60 µL，再向以上各孔均加入 60 µL 酶结合物 ，震荡混 匀；每孔吸取 100 µL转移至包被板对应孔内。 8.7 温育 置37 ℃恒温培养箱中 温育 29 min~31 min。 8.8 洗板 将各孔的液体弃入废液筒，用 300 µL洗涤液洗涤板孔，共洗涤 5次，每次洗涤后应弃去孔内的液体。 最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。 8.9 加入底物 每孔各加入 50 µL的化学发光底物 A和50 µL的化学发光底物 B，振荡混匀（也可 将化学发光底物 A、 B等比例混匀后加 100 µL）。 8.10 静置 在15 ℃~25 ℃条件下避光静置 5 min。 8.11 读值 静置后 15 min内用化学发光仪读 取发光值 。 9 结果计算方法 以校准品 1至校准品 6的发光值为纵坐标， 对应的抗体剂量值 （ 0 NCU /mL、10 NCU/mL 、20 NCU/mL 、 40 NCU/mL 、100 NCU/mL 、200 NCU/mL ）为横坐标，通过 ELISACalc 软件绘制校准品的四参数拟合曲 线，四参数模式为 Y=(a -b)/[1+(x/c) *b]+d。将样本的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中口蹄疫 病毒 A型抗体剂量值。 10 试验成立条件 将6个校准品的发光值与对应抗体剂量值进行四参数拟 合，R2≥0.99，试验成立。否则，试验 不成立。 11 结果判定 将样品的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中口蹄疫病毒 A型抗体的剂量值。如 果样品中 抗 体剂量值＜临界值 20 NCU/mL ，样品判定为阴性；如果样品中抗体剂量值 ≥临界值 20 NCU/mL ，则判定 为阳性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 30-2020 4 附 录 A (规范性) 重组蛋白的制备 A.1 口蹄疫 VP1重组蛋白的制备 A.1.1 生产用菌液繁殖 将生产用细菌种子按 1:100比例转接含卡 那霉素（ 100 µ g/mL）LB液体培养基中，置 37 ℃培养至 OD600nm 值约为 0.65。 A.1.2 重组蛋白的 诱导表达 将生产用菌液 加入终浓度 为1 mmol/L的IPTG，在37 ℃条件下， 220 rpm/min 继续诱导 6 h，收集 诱导表达菌液。 A.1.3 重组蛋白提取和纯化 将诱导后的菌液，在 2 ℃~8 ℃条件下、以 10000 r/min离心 3 min收集菌体，菌体沉淀用适量的超 声破菌缓冲液（ 20 mmol/L Tris- HCl pH 8.0、0.5 mol/L 氯化钠、 1 mMol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重 悬，超声破碎，功率为 300 W，破碎 15 s，间隔 15 s，每个循环 30 s，总时间 20 min。破碎后 的匀浆在 2 ℃~8 ℃条件下、以 12000 r/min离心 10 min，取包涵体沉淀进行纯化，纯化后的产物即为包被抗原。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 30-2020 5 附 录 B (规范性) 口蹄疫A型单克隆抗体的制备 B.1 杂交瘤细胞繁殖 从种子库取出 生产用细胞株 5E12D5，进行细胞复苏。 用含有 15 %胎牛血清的高糖型 DMEM培养 液（pH值7.0）制成细胞悬液，置 37 ℃、含 5 % CO 2培养箱中培养 48 h~72 h，细胞能够稳定分裂繁殖， 可长成单层。 B