ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 20-2020 动物布鲁氏菌实时荧光 PCR检测方法 Real-time PCR method for the detection of Brucella spp. in animal 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 20 -2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构 不承担识别专利的责任 。 本文件由中国兽医协会提 出并归口。 本文件起草单位： 中国兽医药品监察所、 中国动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人： 秦玉明、董浩、原霖、沈青春、丁家波、彭小薇、蒋卉、冯宇、许冠龙、朱良 全、范学政 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 20 -2020 1 动物布鲁氏菌实时荧光 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了动物布鲁氏菌（ Brucella spp. ）实时荧光 PCR的试剂与耗材、仪器与设备、样品、试 验步骤、试验数 据处理。 本文件主要用于布鲁氏菌（ Brucella spp. ）核酸检测 ，样本主要包括：动物脾脏、肝脏、淋巴结、 血液、奶样、精液、 阴道分泌物、流产胎儿内容物 ，也可检测被布鲁氏菌污染 的环境样品 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18646 动物布鲁氏菌病诊断标准 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 1467 奶牛布鲁 氏菌病PCR诊断技术 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂与耗材 4.1 提取试剂 宜选取商品化的细菌基因组 DNA提取试剂盒。 也可按照 NY/T 1467 奶牛布鲁氏菌病 PCR诊断技术进行布 鲁氏菌 DNA提取。 4.2 实时荧光PCR扩增试剂 应按照不同的实时荧光 PCR平台的说明书选取推荐的实时荧光 PCR扩增试剂。 4.3 引物探针 Brucella spp. 上游引物 (Bru F)：5＇-cgctcgcgcggtggat -3＇ Brucella spp. 下游引物 (Bru R)：5＇-cttgaagcttgcggacag tcacc-3＇ Brucella spp.探针 (Bru P)：5＇-FAM - acgaccaagctgcatgctgttg tcgatg-BHQ1 -3＇ 5 仪器与设备 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 20 -2020 2 二级生物安 全柜、分析天平、水浴锅、 高速离心机、 实时荧光 PCR仪、组织研磨器、 -20℃冰箱、 涡旋震荡仪、移液器 。 6 样品 动物脾脏、肝脏、淋巴结、血液、奶样、精液、阴道分泌物、流产胎儿胃内容物等疑似感染布鲁氏 菌病的动物体液或组织样品，也可检测被布鲁氏菌污染的环境样品。 7 试验步骤 7.1 样品的采集及运输 样品采集按照 GB/T 1 8646或NY/T 1467 执行。 样品运输按照农业部公告第 503号执行 7.2 样品的处理 按照GB/T 18646 和NY/T 1467 执行。 7.3 细菌基因组提取 按照所选取的细菌基因组 DNA提取试剂盒说明书进行提取。 7.4 实时荧光 PCR扩增方法 配制布鲁氏菌实时荧光 PCR扩增反应体系见表 1。 表1 布鲁氏菌实时荧光 PCR扩增反应体系 试剂 终浓度 µ mol/L 体积 µL 2×酶混合液a / 10 Bru F（10 µ mol/L ） 0.3 0.6 Bru R（10 µ mol/L ） 0.3 0.6 Bru P（10 µ mol/L ） 0.3 0.6 DNA模板 / 2 无菌无核酸酶水 / 6.2 总体积 20.0 注： a为实时荧光 PCR扩增试剂。 将表 1中所有试剂加到实时荧光 PCR反应管后，充分混匀，做好标记。布鲁氏菌实时荧光 PCR扩增 所用荧光报告基团为 FAM， 淬灭基团为 BHQ或None。 在实时荧光 PCR仪上按表 2所示程序进行扩增反应。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 20 -2020 3 表2 布鲁氏菌实时荧光 PCR扩增程序 7.5 实时荧光 PCR扩增反应的对照 在进行实时荧光 PCR实验时，应设置阳性对照和阴性对照。以提取的布鲁氏菌基因组 DNA溶液或 含有布鲁氏菌 IS711基因全长序列的质粒作为阳性对照；以细菌基因组提取试剂盒的洗脱液替代 DNA模 板作为阴性对照。各对照 PCR扩增体系中，除模板外，其余组分和 PCR扩增程序同 7.4。 8 试验数据处理 8.1 阈值设定 阈值线设定于刚刚超过 阴性对照扩增曲线的最高点。 不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。 8.2 结果判定 8.2.1 阳性对照 Ct值≤38并出现特定的扩增曲线， 阴性对照 无Ct值并且无特征性扩增曲线， 实验结果成立 ， 否则实验结果不成立。 8.2.2 被检样品 FAM荧光信号 Ct值≤38并出现特定的扩增曲线 ，可判定为布鲁氏菌核酸 阳性。 8.2.3 被检样品 38＜Ct值≤40并出现特定的扩增曲线，需重新 取样提取基因组 DNA，复检后仍出现上述 结果的，判为阳性样品，否则判为阴性样品。 8.2.4 被检样品 无Ct值或者无特征性扩增曲线的样品，可 判定为布鲁氏菌核酸 阴性。 9 实验室生物安全要求 9.1 本方法涉及实验室生物 安全管理要求见 GB 19489 。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定 执行。 9.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后按医疗废弃物进 行处理。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后 按医疗废弃物进行处理。 步骤 温度 持续时间 循环数 1 95 ℃ 2 min 1 2 95 ℃ 10 s 40 3 60 ℃ 35 s 注：在每个循环 第二步（ 60 ℃ 35 s ）收集荧光信号。 _________________________________ 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台