ICS 67.120.20 B 40 团体 标准 T/SHZSAQS 015—2020 实时荧光定量 PCR法高效检测绵羊多胎 Fecb 基因SNP位点技术 规程 2020-12 - 26发布 2020 -12 - 31实施 石河子市质量标准化协会 发布 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 015—2020 I 目 次 前言 ................................ ................................ ............... III 1 范围 ................................ ................................ .............. 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ .... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ........ 1 3.1多胎 ................................ ................................ .............. 1 3.2 Fecb ................................ ................................ ............ 1 3.3实时荧光定量 PCR法 ................................ ................................ 1 4主要试剂配制 ................................ ................................ ........ 1 4.1 20 mg/mL 蛋白酶K ................................ .............................. 2 4.2 柠檬酸钠（ ACD）抗凝剂 ................................ ........................... 2 4.3 1mol/L Tris ................................ ................................ .... 2 4.4 0.5M EDTA(pH8.0) ................................ ............................... 2 4.5 TE(pH8.0) ................................ ................................ ....... 2 4.6 PBS ................................ ................................ ............. 2 4.7 DNA抽提缓冲液 ................................ ................................ ... 2 5 检测方法 ................................ ................................ .......... 2 5.1 样本采集 ................................ ................................ ........ 2 5.2 DNA提取 ................................ ................................ ......... 2 5.3 DNA浓度和纯度测定 ................................ ............................... 3 6 引物设计 ................................ ................................ .......... 3 7 实时荧光定量 PCR法检测 ................................ ............................ 3 7.1 实时荧光定量 PCR法反应体系 ................................ ...................... 3 7.2 实时荧光定量 PCR法反应条件 ................................ ...................... 3 8 Fecb基因SNP位点分型结果判断 ................................ ...................... 3 附录A（资料性附录） 荧光定量法检测绵羊多胎 Fecb基因分型标准图谱 .............. 4 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 015—2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 本标准附录 A为资料性附录。 本标准起草单位：新疆农垦科学院畜牧兽医研究所、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：徐梦思、甘尚权、杨鹏、储明星。 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 015—2020 1 实时荧光定量 PCR法高效检测绵羊多胎 Fecb基因SNP 位点技术规程 1 范围 本规程规定了利用实时荧光定量 PCR法检测绵羊多胎主效基因 Fecb的分子检测方法。 本规程适用于绵羊多胎主效基因 Fecb的分子检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用 于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验方法 NY/T 1672 -2008 绵羊多胎主效基因 Fecb分子检测技术规程 3 术语和定义 NY/T 1672 -2008界定的术语和定义适用于本文件。 3.1多胎 指一次分娩产出两个或两个以上胎儿。 3.2 Fecb Fecb是绵羊繁殖性状的主效基因之一，该主效基因被定 位到绵羊6号染色体上，对应于人染色 体4q22-23区间内的骨形态发生蛋白受体 IB（bonc morphogcnctic protein receptor IB ，bmpb-ib）。 绵羊bmpb-ib基因高度保守 区的胞内的A746G突变，导致所编码氨基酸的胞内激酶区域 249位由谷氨 酰胺（Q）变成精氨酸（ R）。研究表明，该突变与绵羊的高繁殖力密切相关。 Fecb即bmpb-ib基因 的746G或249R，Fec+ 即bmpb-ib基因的746A或249Q。一个拷贝 Fecb平均增加排卵数 1.65个，增加产 羔数0.9～1.2只；两个拷贝 Fecb平均增加排卵数 2.7～3.0个，增加产羔数 1.1～1.7只。 3.3实时荧光定量 PCR法 实时荧光定量 PCR法是指对特定核苷酸片断进行指数级扩增的 PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过 Ct值和标准曲线对样品中的 DNA的起始浓度 进行定量的方法 。 4主要试剂配制 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 015—2020 2 4.1 20 mg/mL 蛋白酶K 20 mg蛋白酶K溶于1 mL灭菌双蒸水， -20 ℃保存。 4.2 柠檬酸钠（ ACD）抗凝剂 柠檬酸0.48 g，柠檬酸钠 1.32 g，葡萄糖 1.47 g定容于100 mL水中，高压灭菌 20 min。每 6 mL新鲜血液中加入 1 mL的ACD抗凝剂。 4.3 1mol/L Tris 121.1 g Tris 碱溶于800 mL蒸馏水中，加入浓 HCl调节pH值至8.0，加水定容至 1 L，分装 后高压灭菌。 4.4 0.5M EDTA(pH8.0) 186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na.2H2O）溶于800 mL水中加入，在磁力搅拌器上剧 烈搅拌，用 NaOH调节溶液 pH至8.0，然后定容至 1 L，高压灭菌。 4.5 TE(pH8.0) 1mol/L Tris.Cl(pH8.0) 10 mL 、0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2 mL 加水定容至 1 L，高压灭菌。 4.6 PBS 在700 mL水中溶解 NaCl 8.0 g 、KCl 0.2 g 、Na2HPO4 1.44 g 、KH2PO4 0.24 g ，用HCl调节 pH至7.4,，加水定容至 1 L，高压灭菌。 4.7 DNA 抽提