ICS 11.220 B41 团 体 标 准 T/CAQI 156 —2020 生物样本的单核苷酸多态性（ SNP）位点检测 — 高通量飞行时间质谱法（ MALDI-TOF MS） Detection of single nucleotide polymorphism (SNP) in biological samples MALDI -TOF MS method 2020 -12-18发布 2021-01-20实施 中 国 质 量 检 验 协 会 发布 全国团体标准信息平台 T/CAQI 156—2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本标准的某些内容有可能涉及专利，本标准的发布机构不应承担识 别这些专利的责任。 本标准由中国检验检疫科学研究院综合 检测中心提出，由中国质量检验协 会归口。 本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院综合检测中心，中检科创（北 京）测试认证有限责任公司，中检智联（北京）科技有限公司，溯源生命生物 工程股份有限公司，北京晗旭健康管理集团有限公司，中检汇德健康管理（北 京）有限公司，大连国际旅行卫生保健中心，北京智康源基因科技有限公司、 国正检验认证有限公司，北京佳安卫康科技有限公司，北京金马晟和科技有限 公司，基谱生物科技（上海）有限公司 ，北京泰普舜康 医学检验实验室有限公 司，北京化工大学秦皇岛环渤海生物产业研究院 本标准起草人：乐粉鹏 、姚李四、程帮荣、万谦、张建国、邓滨昌、李洋、 周立成、袁吉泽、姜成涛、高玉峰、聂绚丽、张晗旭、郭汉文、陈菊如 、李鹏 程、王斌、尹峰、万睿、陆杨 本标准专家组成员：张传福、高丽娟、李仁清、崔芳、王琳 全国团体标准信息平台 T/CAQI 156—2020 1 生物样本的单核苷酸多态性（ SNP）位点检测 -- 高通量飞行时间质谱法（ MALDI -TOF MS ） 1 适用范围 本标准为检验实验室进行 药物代谢酶基因、药物转运蛋白基因、药物 作用靶点基因的检测提供技术指导。 本标准适用的样本包括：全血标本、干血片、 咽（口腔） 拭子、唾液 、 组织样本 等。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期 的引用文件， 其最新版本 (包 括所有的修改单 )适用于本文件。 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南 (试行 )，（ 2015年国家 卫生和计划生育委员会医政医管局 国卫医医护便函〔 2015〕240号） 个体化医学检测微阵列基因芯片技术规范（国家卫生 计生委办公厅， 国卫办医函〔 2017〕1190号） 感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南 （国家卫生计生委办公 厅，国卫办医函〔 2017〕1190号） 农业部 1782号公告 -12-2012 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白 质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法 卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增检验实 验室管理办法》 的通知 (卫办医政发〔 2010〕194号) 3、术语和定义 3.1 rs和ss体系 SNP dbSNP数据库制定的 SNP命名体系， rs体系的 SNP代表已获得官方 认可和推荐的参考 SNP（reference SNP ）， ss体系的 SNP代表用户新递交 全国团体标准信息平台 T/CAQI 156—2020 2 但尚未得到认可的 SNP（submitted SNP ）。 3.2 单核苷酸多态性（ SNP） 是指由单个核苷酸 -A、T、C或G的改变而引起的 DNA序列的改变， 造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。 3.3 插入缺失突变（ insert/del mutation ） 插入是将一个或多个额外的核苷酸添加到 DNA中。缺失是指从DNA 中去除一个或多个核苷酸。 另外将小的重复序列如（ TA）3（TA）4也列入 插入缺失突变类型 3.4 等位基因（ allele） 一般是指位于一对同源染色体相同位置上控制某一性状的不同形态 的一对基因。若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状 来说是纯合子。若两个等位基因各不相同，则该个体对该性状来说是杂合 子。 3.5 单体型（ Haplotype ） 一组一条染色体上不同基因的等位基因（如主要的组织相容性复 合体） 的等位基因，这些等位基因紧密相连，通常作为一个单位遗传。 3.6 生物标记物（ biomarker ） 患者标本中所含有的一种特殊的分析物质（如 DNA、RNA、蛋白质等）， 可用于疾病诊断、 判断疾病分期或评价新药或新疗法在目标人群中的安全性和有 效性。 4 原理 样本通过 PCR扩增出含有 SNP位点的一段 DNA，用 SAP酶去除掉 PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸（ dNTP）和引物，然后加入一单 碱基延伸引物， 其 3’末端碱基紧挨 SNP位点， 采用四种 ddNTP替代 dNTP。 这样，探针在 SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的 ddNTP与SNP位点 的等位基因对应。 用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI -TOF MS) 检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。 全国团体标准信息平台 T/CAQI 156—2020 3 5 试剂与耗材 除另有规定，所用试剂均为分析纯。 PCR缓冲液 ,10x(含20mM MgCl 2)；MgCl 2，25mM；聚合酶， 5U/µ L； dNTP Mix ，25mM；超纯水 > 18MΩ.cm@25℃；SAP缓冲液， 10x；虾碱酶 1.7U/µ L；iPLEX GOLD 缓冲液； iPLEX Termination Mix ；iPLEX Enzyme ； 3-Pt标准品； 无水乙醇， HPLC级别；基因芯片。可根据实验需求，选择 其他型号的同等功能的试剂和耗材。 6 仪器与设备 超净工作台或生物安全柜、 PCR扩增仪、纯水仪、电离飞行时间质谱 仪（ MALDI -TOF MS ）、涡旋震荡仪、离心机、摇床 、自动化核酸提取仪 （可选、市售商品化核酸提取试剂盒） 。 7 操作步骤 7.1 样品的预处理 7.1.1口腔拭子 口腔拭子（无保存液） 7.1.1.1向干净的 2ml离心管中加入 300μL Buffer ES 。 7.1.1.2将拭子采样一头剪下，完全浸泡入 2ml离心管中。 7.1.1.3加入 30μL 10×PK Buffer 和10μL Proteinase K （20mg/ml ）， 56℃ 处理 30分钟。 7.1.1.4将处理后的液体全部转移至反应板中。 咽（口腔）拭子（有保存液） Proteinase 法：向装有拭子和保存液的管中加入 30μL 10×PK Buffer 和 10μL Proteinase K （20mg/ml ）， 56℃处理 30分钟。将处理后的液体全部 转移至反应板中。 7.1.2唾液（无需预处理） 7.1.3血液（要求有抗凝剂 ，无血凝块， 无需预处理） 7.1.4血卡 全国团体标准信息平台 T/CAQI 156—2020 4 7.1.4.1 向干净的 2ml离心管中加入 20μL Proteinase K （20mg/ml ）和250μL Buffer 1xCRS 。 7.1.4.2 取一片直径 6mm血卡至 B1所述离心管中， 使血卡完全浸入液体。 7.1.4 .3 56℃，900rpm振摇处理 1h。吸取所有上清转移至反应板进行自动 化处理。 7.1.5组织样本 新鲜冰冻组织样本， OCT包埋冰冻组织样本和石蜡包埋组织样本标准 切片厚度为 4μm，用于核酸提取的切片可以在 10-20μm，但应保证切片 厚度的持续稳定。 7.2核酸提取 可使用试剂盒提取、自动化核酸提取仪进行自动化提取或同类方法。提取后 基因组的 OD260/280 的值应大于 1.80。 7.3 PCR反应 PCR反应试剂种类及用量和反应条件见表 1和表 2。 位点引物对表 详见附录 A 表1 PCR反应试剂种类及用量 反应物名称 反应终浓度 用量 模板 DNA(10ng/ µl) / 1 µL 引物 Mix（0.5μM） 0.1µ M 1 µL 10x缓冲液（含 Mg2+）