ICS 65.150 B 51 山东省食品科学技术学会团体标准 T/SDIFST 0004 —2021 贝类过敏原 的小鼠模型 致敏性评价技术规程 Code of practice for allergenicity assessment of mollusc allergen in a mouse model 2022 -10-28 发布 2022 -10-28 实施 山东省食品科学技术学会 发布 SDIFST 全国团体标准信息平台 T/SDIFST 0004—2021 前言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文本的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国海洋大学提出 。 本文件由 山东省食品科学技术学会 归口。 本文件起草单位： 中国海洋大学 、黑龙江飞鹤乳业有限公司、荣成银海水产有限公司。 本文件主要起草人：李振兴、林洪、张自业 、牟伟丽、解庆刚、 王象欣、姜森。 全国团体标准信息平台 T/SDIFST 0004—2021 贝类过敏原 的小鼠模型 致敏性评价技术规程 1. 范围 本文件确立了贝类过敏原致敏性小鼠模型评价技术规程 ，规定了术语和定义、 一般要求 、仪器设备 、 试剂与溶液配制 、评价流程图 、评价程序的要求。 本文件适用于小鼠模型评价贝类过敏原致敏性过程中的技术操作 。 2. 规范性引用文件 下列文件 中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中， 注日期的引用文件， 仅对该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件， 其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14922.1 实验动物 寄生虫学等级及 监测 GB 14922.2 实验动物 微生物学等级及监测 GB 14924.3 实验动物 配合饲料营养成分 GB 14925 实验动物 环境及设施 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 30891 水产品抽样规范 GB/T 35892 实验动物 福利伦理审查指南 3. 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 贝类过敏原 mollusc allergen 贝类中能够诱发过敏反应的蛋白质。其中，贝类包括但不限于：牡蛎等双壳贝类、螺等单壳贝类、鱿 鱼等头足 贝类。 3.2 贝类过敏原致敏性 mollusc allergen allergenicity 由贝类过敏原诱发机体发生过敏反应的能力 。 3.3 免疫球蛋白 E immunoglobulin E (IgE) 是介导 I型变态反应中起主要作用的免疫分子 。 3.4 过敏小鼠模型 A mouse model for mollusc allergy 利用小鼠建立评价贝类过敏原致敏性的动物模型。 4. 一般要求 4.1 实验人员应 具有动物实验从业人员资格证书。 4.2 小鼠动物应选用无特殊病原体级（ SPF级） BALB/c雌性成年小鼠（ 6周龄～ 8周龄） ，质量应符合 GB 14922.1和GB 14922.2的规定，具有实验动物质量合格证。 4.3 动物饲养实验小鼠饲养条件应符合 GB 14925 和GB 19489 的规定，饮用水应符合 GB 5749 的规定，饲 料应符合 GB 14924.3 的规定。 全国团体标准信息平台 T/SDIFST 0004—2021 4.4 本试验所需动物实验室应符合生物安全一级要求。实验室工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、 动物房组成。 其中， 缓冲间面积应不小于 3 m2， 并设有更衣柜和紫外灯， 紫外灯的强度为不少于 1.5 W/m3。 紫外灯源距离地面不应超过 2.5 m，每次照射时间为 20 min~30 min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万 级。 4.5 动物伦理审批应按照 GB/T 35892 的规定对小鼠动物的福利伦理进行审查。 4.6 评价实验结束后，小鼠动物尸体应按 GB 14925 的规定进行处理。 4.7 贝类样品取样应符合 GB/T 30891 水产品抽样规范的规定。 5. 仪器设备 5.1 酶标仪 波长范围： 330 nm～1100 nm、吸光度范围： 0.000 A～4.000 A。 5.2 分析天平 感量 0.01 g、0.0001 g。 5.3 移液器 1 mL、5 mL。 5.4 离心机 最大离心力大于 6000 × g。 5.5 微孔滤膜 滤膜孔径 0.22 μ m。 5.6 磁力搅拌器 转速范围 : 50 r /min～1500 r /min。 5.7 组织匀浆机 转速范围 : 5000 r/min～12000 r/min 、可均质样品范围 : 0.03 mL ～2000 mL。 5.8 医用注射器 注射器容量 1 mL。 5.9 低温冰箱 冷藏室温度 0℃～10℃、冷冻室 -10℃～-20℃。 5.10 超低温冰箱 冷冻室温度 -40℃～-80℃。 6. 试剂与溶液配制 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水应符合 GB/T 6682 一级水的规定。 6.1 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（ PBS缓冲液） 称取 7.90 g氯化钠、 1.44 g磷酸氢二钠、 1.80 g磷酸二氢钾、 0.20 g氯化钾，用 980 mL水溶解，用盐 酸调节 pH至7.2，再加水定容至 1000 mL，0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌， 4 ℃保存备用。或选用同类商品化 产品。 6.2 抽提缓冲液 称取 74.55 g 氯化钾， 2.42 g 三羟甲基氨基甲烷， 77.00 mg 二硫苏糖醇，用 800 mL超纯水溶解后，调 pH至7.5，然后用超纯水定容至 1000 mL。 6.3 包被液 全国团体标准信息平台 T/SDIFST 0004—2021 称取 0.29 g 氢氧化钠和 0.16 g 碳酸钠溶于适量超纯水中，而后用超纯水定容至 100 mL。 6.4 终止液 量取 10.88 mL 质量分数为 98%的浓硫酸，缓缓加入到适量超纯水中，待冷却至室温后，用超纯水定 容至 100 mL。 6.5 TBST缓冲液 称取 8.755 g 氯化钠， 2.422 g三羟甲基氨基甲烷， 0.5 mL吐温 -20，加入 800 mL超纯水溶解后，用 1 mol/L的盐酸调 pH至7.5，定容到 1000 mL。 6.6 羊抗鼠 IgE二抗 纯度 >95%，可选用同类商品化产品。 6.7 TMB显色液 可选用各种同类商品化产品。 6.8 氢氧化铝佐剂 可选用各种同类商品化产品。 7. 评价流程图 贝类过敏原 致敏性评价流程包括 6个步骤，评价流程图见图 1。 图1 贝类过敏原致敏性评价流程 8. 评价程序 8.1 贝类过敏原样品制备 8.1.1 贝类取样参照 GB/T 30891 ，将贝类去壳和内脏 后取肌肉组织， 剪碎成 1 mm× 1 mm× 1 mm大小的碎 块，组织匀浆机（ 5.8）10000 r/min 匀浆 5 min后，加入 10倍体积（ W/V）的95%酒精（V/V），于 4℃固 定8 h。 8.1.2 用离心机（ 5.5）6000 × g离心 15 min，取沉淀。 8.1.3 加入 2倍体积（W/V）的丙酮乙醚混合液 （V/V=2:1），覆膜，在4℃操作间内 ，磁力搅拌 器1000 r/min 搅拌 4 h后，6000 × g离心 15 min，取沉淀。此步骤重复三次。 8.1.4丙酮乙醚混合液 6000 × g离心 15 min，取沉淀， 将沉淀在室温下通风橱内干燥 8 h后，研磨成粉末 状，得贝类丙酮粉 。 8.1.5 取10 g贝类丙酮粉，加入 20倍体积（ W/V）的抽提缓冲液（ 6.2），磁力搅拌器 搅拌（1000 r/min）抽 提12 h。 8.1.6 6000 × g离心 15 min，取上清液 。 8.1.7 上清液用 0.22 μ m微孔滤膜滤过除菌， 冷冻干燥后 -20 ℃保存，得到过敏原样品 。 8.2 过敏小鼠模型 构建 8.2.1 BALB/c 小鼠分组 商业无特殊病原体级（ SPF级） BALB/c小鼠（雌性， 6周龄～ 8周龄，体重 20g±2g） ，饲养于 SPF级 动物房（ 5.1）屏障环境中，温度为 25℃±2℃ ，湿度为 50%±5%，12 h光照， 12 h黑夜，饲料不含贝类过敏 原成份，自由摄食、饮水。所有小鼠饲养 1周适应新环境后，随机等分为 2组，分别为贝类过敏原组和阴 全国团体标准信息平台 T/SDIFST 0004—2021 性对照组（ PBS组） ，每组 5只～8只。 8.2