葡萄酒中 6种花青素的测定 液相色谱 -质谱 /质谱法 团 体 标 准 T/ NAIA 0147-2022ICS 67.160.10 CCS X 62 2022-09-09发布 2022-09-30实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 TB 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》规定编写。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 ，本文件的起草和发布机构不承担识别专利的责 任。 本文件由银川智慧食品安全检验检测中心（有限公司）提出。 本文件由宁夏化学分析测试协会归口。 本文件起草单位 ：银川智慧食品安全检验检测中心（有限公司 ）、银川汇创资本投资股 份有限公司、宁夏化学分析测试协会。 本文件主要起草人 ：田婧、陈红丽、张宝明、田碧桃、许云霄、何健辉、孔坚、冒莉萍、 钱克俊、朱清苗、张小飞。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 4葡萄酒中 6种花青素的测定 液相色谱 -质谱 /质谱法 1 范围 本文件规定了葡萄酒中 6种花青素含量的液相色谱 -质谱 /质谱法的测定方法。 本文件适用葡萄酒中飞燕草色素 、矢车菊色素 、矮牵牛色素 、天竺葵色素 、芍药素、锦 葵素含量的测定和确证。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期 的引用文件， 仅该日期对应的版本适用本文件 ；不注日期的引用文件，其最新版本 (包括所 有的修改单 ) 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样经乙醇 -水的强酸溶液超声提取花色苷后，经沸水浴将花色苷水解成花青素，用液 相色谱 -质谱 /质谱法测定，外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 甲醇 (CH 3OH) ：色谱纯。 5.1.2 盐酸 (HCl) ：分析纯。 5.1.3 无水乙醇（ C2H5OH）：分析纯。 5.1.4甲酸（ CH 2O2）：分析纯。 5.2 试剂配制 5.2.1 10%盐酸甲醇溶液： 取10 mL盐酸、加入到 90 mL甲醇中，混匀。 全国团体标准信息平台 55.2.2 提取液：无水乙醇 +水+盐酸 =2+1+1（V+V+V），量取 200 mL无水乙醇、 100 mL水、 100 mL盐酸混匀即得。 5.3 标准品 飞燕草素 标准品（ CAS：528-53-0）：纯度≥ 96%，或经国家认证并授予标准物质证书 的标准物质。 矢车菊素标准品（ CAS：528-58-5）：纯度≥ 98%，或经国家认证并授予标准物质证书 的标准物质。 矮牵牛素标准品（ CAS：1429-30-7 ）：纯度≥ 96%，或经国家认证并授予标准物质证书 的标准物质。 天竺葵素标准品（ CAS：134-04-3）：纯度≥ 96%，或经国家认证并授予标准物质证书 的标准物质。 芍药素标准品（ CAS：134-04-0）：纯度≥ 98%，或经国家认证并授予标准物质证书的 标准物质。 锦葵素标准品（ CAS：643-84-5）：纯度≥ 96%，或经国家认证并授予标准物质证书的 标准物质。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 标准储备溶液 (100 μg/mL)：分别准确称取各标准物 1.0 mg到烧杯中 ，用适量的 10%的 盐酸甲醇溶液溶解， 转移至 10 mL容量瓶中， 用10%盐酸甲醇溶液溶解清洗烧杯三次，合 并清洗液到容量瓶中 ，定容至10 mL，混合均匀后 得到 100 μg/mL的单标标准储备液 ，贮存 于棕色密闭玻璃瓶中，于 -18℃下保存， 有效期 3个月。 5.4.2标准工作液：将单一标准储备液进行混合后， 用10%盐酸甲醇溶液作为溶剂，并逐级 稀释成 0.2 μg/mL、0.3 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、2μg/mL、3 μg/mL、6μg/mL。混合标 准工作液现用现配。 6仪器和设备 6.1 高效液相色谱 -串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ ESI）。 6.2 分析天平： 感量分别为 0.1 mg和0.01 g。 6.3恒温水浴锅。 6.4超声波清洗器。 全国团体标准信息平台 67分析步骤 7.1 试样制备 将所取原始样品在瓷混样桶内充分混匀，将混匀样品置于洁净容器内密封，作为试样 。 7.2 试样前处理 称取上述样品 1.00 g于50 mL具塞刻度试管中，用提取液定容至刻线， 混匀 1 min后， 超声提取 30 min。超声提取后， 于沸水浴中水解 1 h，取出冷却后，用提取液再次定容，静 止，取上清液， 用0.22 μm水相滤膜过滤，待测。 7.3测定 7.3.1液相色谱参考条件 a）色谱柱： 选用 C18 (1.7μm，2.1 mm×50 mm)液相色谱柱。 b）柱温： 35℃。 c）流动相： A为0.1%甲酸水溶液， B为乙腈；梯度洗脱见表 1。 d）流速： 0.20 mL/min。 e) 进样量： 5 μL。 表1 流动相及梯度洗脱条件 时间 /min A 0.1%甲酸水溶液 （%） B 乙腈（ %） 0 92 8 2.00 92 8 7.00 75 25 8.00 70 30 9.00 72 28 10.00 92 8 15.00 92 8 7.3.2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ ESI）。 b) 扫描方式：正离子扫描。 c) 检测方式：多反应监测（ MRM）。 d) 离子源温度： 150℃。 全国团体标准信息平台 7e) 溶剂洗脱温度： 450℃。 f) 锥孔电压： 18V。 g) 毛细管电压： 4.5KV。 h) 定性离子对、定量离子对、 碰撞能量等参数参见表 2。 表2 六种花青素的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能 中文名称 定性离子对 /(m/z) （母离子 /子离子） 定量离子对 /(m/z) （母离子 /子离子） 锥孔电压 /V 碰撞能 /eV 303.100/229.000 30 30 飞燕草素 303.100/257.000 303.100/229.000 30 28 287.100/108.900 30 32 矢车菊素 287.100/137.000 287.100/108.900 30 42 317.100/203.000 20 24 矮牵牛素 317.100/302.000 317.100/203.000 20 38 306.87/121.008 14 42 天竺葵素 306.87/93.05 306.87/121.008 14 46 301.047/286.049 40 40 芍药素 301.047/201.085 301.047/286.049 40 25 331.200/242.000 6 28 锦葵素 331.200/315.100 331.200/242.000 6 30 7.3.3 定量测定 根据样液中被测物含量情况 ，选定浓度相近的混合标准工作溶液 ，混合标准工作溶液和 待测样液中 6种花青素的响应值均应在仪器检测的线性范围内 。混合标准工作溶液与样液等 体积进样测定 。标准溶液及样液均按 7.3.1和7.3.2规定的条件进行测定 ，如果样液中与标准 溶液相同的保留时间有峰出现，则对其进行确证。飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、 天竺葵色素、芍药素、锦葵素标准品的多反应监测（ MRM）色谱图参见附录 A，采用标准 曲线外标法定量。 8 结果计算 按以下公式计算测定结果。 全国团体标准信息平台 8计算公式： ………………………………… （1） 式中： X — 试样中各花青素的含量，单位为微克每千克（ mg/kg）； C — 进样溶液中花青素的浓度，单位为纳克每毫升（ g/mL）； V — 定容体积，单位为毫升 (mL)； m — 试样的称样量，单位为克（ g）； 1000 —换算系数。 测定结果取两次测定的算数平均值，计算结果保留三位有效数字。 9精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。 10 检出限 飞燕草色素 检出限为 1.5mg/kg 、锦葵色素 、矮牵牛色素 、矢车菊色素 、天竺葵色素 、芍 药素检出限均为 1mg/kg。 10001000 mVcX 全国团体标准信息平台 9附录 A （资料性附录） 6种色素多反应监测（ MRM）色谱图