ICS 71.100.70 C2682 Y42 团 体 标 准 T/SHRH 027-2019 _________________________________________________________ _______________________________ 体外测试 B16细胞黑素合成抑制实验 In Vitro Test -Inhibition of M elanin Synthesis in B16 Cells Test 2019-12-30发布 2020-01-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 T/SHRH 全国团体标准信息平台 T/SHRH 027-2019 1 目 次 前言…………………………………………………………………………………………… 2 1．范围………………………………………………………………………………………… 3 2. 原理……………………………………………………………………… ……………… 3 3. 测试仪器 …………………………………………………………… …………………… 3 4. 试剂…………………………………………………………………… ………………… 3 5. 试验方法 …………………………………………………………………… …………… 3 6. 结果计算 ……………………………………………………………………… ………… 4 7. 试验有效性认证 …………………………………………………………………… …… 4 8. 结果报告 …………………………………………………………………… …………… 4 全国团体标准信息平台 T/SHRH 027-2019 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1 -2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 上海家化联合股份有限公司、 东阿阿胶股份有限公司、 上海上美化妆品有限公司 、 上海创元化妆品有限公司、广东博溪生物科 技有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、上海绿瑞生物 科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海清轩生物科技有限公司、上海天祥质量 技术服务有限公司、 上海日用化学品行业协 会。 本标准主要起草人： 陈媛祺、曹平、陈田、 廖峰、 陈静、廖筝筝、曾四立、吴梅芳、卢永波 、陈 贞明、谢阿贵 、姜春鹏、赵奕竹 、马骁、王飞飞 、高宏旗、朱翠翠、 李琼、金坚、陈亦华 。 全国团体标准信息平台 T/SHRH 027-2019 3 体外测试 B16细胞黑素合成抑制 试验 1 范围 本标准规定了 B16细胞黑素合成抑制 试验的基本技术要求，提 供一种美白原料的细胞评估方法，适 用于宣称通过抑制黑素生成而达到美白效果的原料的功效评价。 2 原理 B16小鼠黑素瘤细胞是常用的研究黑素生成的细胞模型，通过测定美白原料作用于黑素细胞后黑素 合成量的变化，评价原料的美白活性。 3 测试仪器 3.1 分析天平：精度 0.1 mg； 3.2 CO 2培养箱； 3.3 倒置显微镜； 3.4 离心机； 3.5 可调节移液枪： 1000 μ L、200 μL、50 μL、10 μL； 3.6 细胞计数器； 3.7 恒温水浴锅； 3.8 生物安全柜； 3.9 酶标仪。 4 试剂 除有另外说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水 ，与细胞培养相关试剂、 耗材均需经过无菌处理。 4.1 B16细胞； 4.2 细胞培养涉及试剂 及耗材：1╳ PBS、细胞培养液（ DMEM（1╳ ，含4.5g/L D -Glucose） +10 % 胎牛血清 + 1 % 混合抗生素（100╳））、0.25% Trypsin （1╳）、6孔细胞培养板 、96孔细胞培养板、 细胞培养瓶 ； 4.3 黑素提取液： 配制含有 10 % DMSO的1 mol/L NaOH 。 5 试验方法 5.1 细胞收集：吸掉培养瓶中的培养液，用 1╳ PBS洗两遍，然后加入 0.25% Trypsin（1╳）（T 25培养瓶中加入 500 μL，T 75培养瓶中加入 1mL），放入 CO 2培养箱中消化 3-5分钟，显微镜 全国团体标准信息平台 T/SHRH 027-2019 4 下观察细胞脱离培养瓶 后，即可加入 5 mL细胞培养液终止消化，并收集培养瓶中的细胞于离心 管中， 1000 rpm离心 3分钟。 5.2 细胞计数：弃去上清，细胞重新悬浮于离心管中，计数细胞浓度。 5.3 细胞铺板： 用细胞培养液 调整细胞密度 至2.5× 103 个/ mL，然后将细胞悬液铺于 6孔板中， 每孔 2 mL。注：每次测试需设定阴性对照组 、受试样品组和阳性对照组， 每组均设立三个复孔 。 5.4 样品配制： 待测样品的浓度应选择不影响细胞生长的浓度 ，即为细胞的无毒浓度。 液体样 品需过滤除菌， 再用细胞培养液稀释至相应的浓度； 水溶性固体样品先用 1╳ PBS溶解至高浓度， 后过滤除菌，再用细胞培养液稀释至相应的浓度；非水溶性的样品先用 DMSO溶解至高浓度， 再用细胞培养液稀释至相应的浓度，应保证最后培养液中所含的 DMSO浓度不超过 1 %。 5.5 第一次换液：铺好的 6孔板在 37 ℃，5 % CO 2培养箱中放置 20-24小时后，将细胞培养液 换成含有受试样品的培养液，每孔 2 mL，继续培养 48小时。注：阴性对照组仅含细胞培养液 ， 阳性对照 组需要加入含有 阳性物质 的细胞培养 液。 5.6 第二次换液： 第一次换液 48小时后， 重复步骤 5.4，更换细胞 培养液，每孔调整为加入 3 mL 含相应样品的培养液，在 37 ℃，5 % CO 2培养箱中继续培养。 5.7 第三次换液： 第二次换液 72小时后，重复步骤 5.4，更换细胞 培养液，每孔加入 3 mL含样 品的培养液 ，在 37 ℃，5 % CO 2培养箱中继续培养。 5.8 检测：第三次换液 48-72小时后（细胞融合率达到 90 %以上），测定细胞黑素含量。用 1 ╳ PBS洗两遍细胞，吸去 PBS，每孔加入 200 μL 0.25 %胰酶消化细胞，放入 CO 2培养箱中消化 5分钟。分两次加入 2 mL PBS吹打细胞，将细胞收集入离心管中， 4000 rpm离心 5分钟。尽量 吸净离心管中 PBS残液，在每管中加入 200 μL的黑素提取液，震摇均匀，放入 80 ℃水浴中加 热1小时。冷却后，适度离心下管壁液滴，吹打均匀，吸取各离心管中的 150 μL溶液，移入 96 孔板中，酶标仪检测各孔 405 nm处吸光度。 6 结果计算 计算黑素合成抑制率： %100CCT-C）% 抑制率（ 0 ………………………………………… （1） （1）式中： T—受试样品孔 吸光度； C—阴性对照组 吸光度的3次平均值； C0—黑素提取液本 底吸光度。 7 试验有效性验证 7.1 每批次试验都须加入阳性对照 组，要求每批次测试阳性对照均能检出抑制 B16细胞合成黑 素的效果，且与阴性对照相比 ，具有统计学差异，则认为试验系统有效。阳性对照可选择曲酸。 7.2 统计酶标仪 测得的各组平行孔间 吸光度的标准差（Standard Deviation ，SD），并计算 变异 系数（Coefficient of Variation ，C.V），C.V值须≤ 20%，则认为试验平行性有效。 8. 结果报告 全国团体标准信息平台 T/SHRH 027-2019 5 8.1 样品在某一受试浓度下的对黑素合成的抑制率应表述为： 抑制率平均值 ±抑制率间的标准差 （SD）。 8.2 评价样品抑制 B16细胞合成黑素的 能力，需要受试样品组与阴性对照组 的检测值具有统计 学差异（ p < 0.05）。 8.3 对于样品抑制 B16细胞黑素合成的表述， 应包含受试浓度。 _________________________________ 全国团体标准信息平台