ICS 11.220 B 41 MA 团体标准 T/CVMA 8—2018 动物 A型流感病毒微滴式数字 RT-PCR检 测方法 Method of droplet digital RT-PCR for detection of influenza A virus 2018 - 10 - 24发布 2018 - 10 - 24实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 8—2018 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心 、上海市动物疫病预防控制中心 。 本标准主要起草人： 刘玉良、王传彬、杨林、周锦萍、宋晓晖、辛盛鹏、原霖、鞠厚斌、董浩、顾 小雪、杨德全、徐琦、亢文华、汪葆玥、马英、王晓英、 陈亚娜。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 8—2018 1 动物 A型流感病毒微滴式数字 RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了动物 A型流感病毒 （Influenza A Virus ）微滴式数字 RT-PCR检测方法 的试剂与耗材、 仪器与设备、操作步骤、结果分析 。 本标准适用于动 物A型流感病 毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 微滴式数字 PCR（Droplet Digital PCR ，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份 反应体系 分成 数万个纳升级的微滴 进行定量 PCR检测，本质上 是将传统定量 PCR的一次检测变成数万次检测 ，提高了 检测的灵敏度和精准度。微滴发生器 可以将每一份扩增体 系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不 含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都 将作为一个独立的 PCR扩增体系 ，在PCR扩增仪上 进行终点 PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为 1，没有荧光 信号的微滴判读为 0。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数 。 4 试剂与耗材 4.1 提取试剂 宜选取商品化的 病毒 RNA提取试剂盒。 4.2 微滴式数字 RT-PCR扩增试剂 宜按照不同的微滴式数字 PCR平台的说明书选取推荐的微滴式数字 RT-PCR扩增试剂。 4.3 引物和探针 AIV上游引物 （Flu-A-F）：5＇- AGATGAKTCTTCTAACCGAGGTCG -3＇ AIV下游引物 （Flu-A-R）：5＇- TGCAAAGACATCTTCDAGTCTCTG -3＇ 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 8—2018 2 AIV探针（Flu-A-P）：5＇-FAM - TCASGCCCCCTCVAAGCCGA -BHQ 1-3＇ 5 仪器与设备 生物安全柜 、PCR扩增仪、数字 PCR微滴发生器 、数字 PCR微滴分析仪、纯水仪、核酸定量仪 、涡 旋震荡仪。 6 操作步骤 6.1 样品采集及运输 按照 NY/T 541 执行。 6.2 RNA提取 按照所选取的病毒 RNA提取试剂盒 说明书进行提取。 6.3 微滴式数字 RT-PCR扩增方法 每个样品微滴式数字 RT-PCR扩增设置 3个平行。微滴式数字 RT-PCR扩增体系配制如表 1。该步骤按 照不同微滴式数字 PCR平台的说明书进行操作。 表1 微滴式数字 RT-PCR扩增体系 试剂 终浓度 体积 2×酶混合液a / 10 μL Flu-A-F（10 μmol/L ） 0.5 μmol/L 1 μL Flu-A-R（10 μmol/L ） 0.5 μmol/L 1 μL Flu-A-P（10 μmol/L ） 0.1 μmol/L 0.2 μL RNA模板 / 2 μL 无核酸酶 水 / 5.8 μL 总体系 / 20 μL 注：使用微滴式数字 PCR平台进行实验 时，应依据不同微滴式数字 PCR平台依据调整 扩增体系 的组分和最终体积，表中所列组分的终浓度不变。 a 微滴式数字 RT-PCR扩增试剂。 反应液配制后，使用微滴发生器对扩增体系进行微滴生成。微滴生成 后，进行微滴式数字 RT-PCR 扩增。荧光分析步骤采用 FAM单荧光通道， 微滴式数字 RT-PCR扩增程序如表 2所示。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 8—2018 3 表2 微滴式数字 RT-PCR扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 42 ℃ 60 min 1 2 95 ℃ 10 min 1 3 95 ℃ 30 s 40 4 55 ℃ 1 min 5 98 ℃ 10 min 1 6 4 ℃ 60 min 1 注：升降温速率设置为 2.5 ℃/s。 6.4 微滴式数字 RT-PCR反应的对照 在进行微滴式数字 RT-PCR实验时，应设置 阳性对照、 阴性对照与空白对照。 以提取的动物 A型流 感病毒 RNA溶液作为阳性对照；以 提取的 A型流感病毒 阴性动物组织 悬液核酸作为阴性对照；以 无核酸 酶水作为空白对照。各对照 RT-PCR扩增体系中，除模板外，其 余组分和RT-PCR扩增程序同6.3。 7 结果分析 7.1 实验成立条件 微滴式数字 RT-PCR扩增结果，有效微滴数不得低于理论微滴数的 60 %。阴性对照组和空白对照组 均未检出阳性微滴，阳性对照有明显阳性微滴，且核酸拷贝数浓度 ≥10 copi es/μL，则实验成立。 7.2 阈值设定 微滴式数字 RT-PCR结果中，阴性微滴和阳性微滴明显分开，阈值设在阴性微滴和阳性微滴分开的 区域。 7.3 结果判定 样品中检测出阳性微滴 ，且阳性核酸拷贝数 ≥10 copies/μL ，则判定为阳性。 样品中检测出阳性微滴 ，阳性核酸拷贝数 ＜10 copie s/μL，则需复检 。若复检结果仍 检测出阳性微 滴，则判定为阳性，否则判定为阴性。 样品中未检出阳性微滴 ，则判定为阴性。 _________________________________ 中国兽医协会 CVMA