ICS 65.020.30 B 44 中国实验动物学会团体标准 实验动物

不同毒力耐多药结核菌
T/CALAS 111-2021 用于体内外药效评价技术规范
Laboratory animal In vitro and in vivo efficacy evaluation of mu ltidrug-resistant tuberculosis with different virulence 2022-01-10 发布 中国实验动物学会 2022-01-10 实施 发布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草 规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国实验动物学会归口。 本文件由全国实验动物标准化技术委员会（ SAC/TC281 ）技术审查。 本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。 本文件起草单位：中国医学科学院医学实验动物研究所。 本文件主要起草人：秦川、占玲俊。 全国团体标准信息平台 实验动物 不同毒力耐多药结核菌用于体 内外药效评价技术规范 1 范 围 本文件提供了利用强毒或弱毒耐多药临床结核菌株的体外最小抑菌浓度（ minimal inhibitory concentration ，MIC ）测定，以及小鼠模型中药效方法，包括模型制备所需要的 耐多药结核菌株的筛选、体外 MIC 测定、不同毒力耐多药动物模型制备、病理学和组织 菌量评价的方法。 本文件适用于临床耐药结核分枝杆菌的体外药敏测试，建立体内药效评价的动物模型 和评价方法， 用于评价不同类型药物对不同毒力临床耐药结核分枝杆菌体内的药效。 同时，该技术规范也可以作为其他临床耐药菌的体内外药效评价技术规范的参考。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版 本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 《实验室 生物安全通用要求》 GB 14925 《实验动物 环境及设施》 国家科学技术委员会令第 2号 《实验动物管理条例》 《中国药典》（ 2020 年） 《药物非临床依赖性研究技术指导原则》（国食药监注﹝ 2007 ﹞643号） 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 组织荷菌量 bacterium burden in tissue 单位质量的组织样本中细菌的负荷量，即菌量。 4 缩略语 RIF 利福平（ rifampin ） EMB 乙胺丁醇（ ethambutol ） Mtb 结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis ） 全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）
118 HE染色 苏木精 -伊红染色（ hematoxylin-eosin staining ） CFU 菌落形成单位（ colony forming unit ） MIC 最小抑菌浓度（ minimal inhibitory concentration ） DMSO 二甲基亚砜（ dimethyl sulfoxide ） PBS 磷酸缓冲盐溶液（ phosphate buffer saline ） OADC 生长添加剂 油酸清蛋白葡萄糖过氧化氢酶添加剂（ oleic albumin dextrose catalase supplement ） 5 试剂和材料 a）灭菌生理盐水。 b）抗结核的阳性对照药。 c）4%稀硫酸。 d）罗氏培养基、 MGIT960 培养管。 e）10%福尔马林溶液。 f）75%乙醇。 e）组织匀浆管。 h）1 mL 、5 mL 、10 mL 移液管。 e）100 μL、200 μL、1 mL 加样枪和枪头。 j）一次性平皿。 k）解剖剪、镊子。 l）生物安全操作的防护用品（帽子、口罩、手套、垃圾袋、防护服、防渗漏垫等）。 m）异烟肼、利福平和链霉素。 6 仪器和设备 a）CO 2培养箱。 b）倒置显微镜。 c）电动移液器。 d）生物安全柜。 e）组织匀浆机。 f）组织切片机。 g）MGIT960 分枝杆菌快速培养系统（美国 BD公司）。 7 实验方法和要求 7.1 实验室生物安全要求 药效评价用的菌株制备、小鼠的感染、解剖取样和检测按照 ABSL-3 实验室生物安全 要求执行，参见 GB 19489 。 全国团体标准信息平台 119 实验动物 人源肿瘤异种移植小鼠模 型制备技术规范 7.2 代表性耐多药临床菌株的筛选要求 筛选满足基因型、耐药表型和耐药突变位点要求的菌株，进一步进行小鼠体内毒力实 验，具体方法是：用 1.0×108 CFU/mL 结核耐药菌液 100 μL或200 μL感染小鼠，以国际 公认的标准药物敏感株 H37Rv 为对照， 30天内观察小鼠的死亡情况，记录小鼠半数死亡 时间。结果显示：与国际标准株 H37Rv 相比，分别挑选弱毒和强毒耐多药菌株，如编号 8462 和94789 耐多药菌株作为实验用菌株。 7.3 MIC 检测用的标准株 H37Rv 和耐多药菌株的制备要求 80℃或液氮低温保存的 Mtb 标准株 H37Rv 及耐多药结核菌 94789 、8462 单细胞悬 液，要求浓度为 1.0×107 CFU/mL （colony forming unit/mL ），用生理盐水稀释浓度调至 0.5个麦氏浊度后备用。 7.4 BD MGIT960 药敏试验 7.4.1 受试物 PP的溶解和稀释 根据药物和受试物的溶解特性，选择合适的溶质（ DMSO 、PBS 或水等），配成工作 浓度，并用 0.22 µm 滤器过滤获得无菌的药物或受试物溶液。 7.4.2 对照药的溶解和稀释 对照药异烟肼、利福平和链霉素的浓度可选择 10 mg/mL 。 7.4.3 BD MGIT960 药敏试验工作菌液的制备标准 按照 1∶5稀释的 0.5个麦氏浊度的菌种放入 MGIT960 系统中经过一次培养，培养报 阳的菌液作为第二步药敏试验的工作菌液。 报阳当天为第 0天，报阳后至少培养 1天，第 1天或第 2天菌液可直接作为药敏试验 的工作菌液。第 3～5天以后的菌液需要 5倍稀释得到工作菌液。 7.4.4 BD MGIT960 系统进行药敏试验的程序 7.4.4.1 生长对照管菌液的制备方法 需将药敏试验工作菌液 0.1 mL 加入 10 mL 生理盐水， 100倍稀释。 7.4.4.2 药敏试验的试验管准备方法 取所需数量的 MGIT960 系统的培养管，每管加入 OADC 生长添加剂 0.8 mL 。生长对 照组每管加入生长对照菌液 0.5 mL 。 试验管每管 7 mL 液体中加入不同浓度的 0.1 mL 受试 药液或者对照药异烟肼、利福平、链霉素等，药物浓度采用倍比稀释的方法，要求至少确 定10个浓度梯度值。所有试验管中工作菌液为 0.5 mL/ 管。 7.4.4.3 利用 BD MGIT960 系统检测药物的 MIC 将所有检测的管做好标记，扫描管上条形码后放入 MGIT960 培养系统，根据管号记 录报阳时间和生长单位。 7.4.4.4 MIC 结果的判定方法 根据不同药物浓度梯度的试验管报阳时间和生长单位，找到报阳和报阴试验管的药物 浓度临界值，确定为该药物的 MIC 值。 全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）
120 7.5 动物感染用的菌株的制备要求 a）模型制备的菌浓度要求： H37Rv 菌液稀释成浓度为 1.0×107 CFU/mL ，强毒耐多药 结核菌株 94789 菌液稀释成 1.0×105 CFU/mL ，弱毒耐多药结核菌株 8462 菌液稀释成 1.0× 106 CFU/mL 。 b）注射剂量（体积）：每只小鼠注射菌液体积为 100 μL。 7.6 动物体内药效评价实验程序 7.6.1 小鼠感染 a）实验小鼠要求： SPF 级6～8周龄雌性 C57BL/6 小鼠，设置空白对照组、模型对照 组、对照药物组和实验组，每组 10只。 b）感染途径：小鼠尾静脉。 c）感染菌液的剂量和浓度要求： 1.0×107 CFU/mL H37Rv 菌液 100 μL、1.0×105 CFU/mL 94789 菌液 100 μL和1.0×106 CFU/mL 8462 菌液 100 μL。 7.6.2 给药方法 a）给药途径：灌胃。 b）给药剂量或体积：一般 0.2 mL ，最大不超过 0.8 mL 。对照药的剂量参考成人用量 换算成小鼠的剂量，受试药物根据药代情况确定剂量，某些药物可按浓度梯度给药。 c）给药时间、频次和周期：根据药代情况可以在感染