ICS67.050 CCSX28 团体标准 T/ZSSP0021-2022 2022-12-30发布 2022-12-30实施 中山市食品学会发布焙烤食品中丙烯醛的快速测定 酶标仪法（荧光探针法） Rapiddeterminationofacroleininbakedfood——Microplatereader method(fluorescentprobemethod) 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/ZSSP0021—2022 I前  言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中山市食品学会和中山洪力健康食品产业研究院有限公司共同提出。 本文件由中山市食品学会归口。 本文件起草单位：中山市食品学会、中山市食品药品审评认证中心、暨南大学、中山海关技术中心、 中山洪力健康食品产业研究院有限公司、广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心）、利 诚检测认证集团股份有限公司、华南农业大学、中山市第一职业技术学校、广州广电计量检测股份有限 公司、中山市食品药品检验所、中山联测检测技术有限公司、中山市农产品质量安全检验所、中山永恒 检测科技有限公司、廉江市检验检测中心、创味舌尖冻干食品科技（中山）有限公司、咀香园健康食品 （中山）有限公司、中山市日威食品有限公司、中山市百威食品有限公司、广东药科大学、中山火炬职 业技术学院、广东省焙烤食品产业技术创新联盟。 本文件起草人：黎文媛、黄才欢、冯雪雅、张延杰、欧仕益、孟嫚、杜冰、黎攀、唐雪娟、黄雪碧、 黄景辉、郑洁、黄思韵、李芸、胡晓涛、谭应职、冯鹏、陈丽红、胡志高、莫康扬、刘付、江楷煜、龚 启宙、郑萍、李蓉、张逸、罗紫明、吴小勇、李向丽、刘霭莎、何雁虹、陈林清、彭丽谕、李菲菲。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/ZSSP0021—2022 1焙烤食品中丙烯醛的快速测定 酶标仪法（荧光探针法） 1范围 本文件规定了焙烤食品中丙烯醛含量测定的荧光法快速测定的原理、试剂和材料、仪器设备、样品 制备、试验步骤、试验数据处理、精密度和试验报告等。 本文件适用于焙烤食品中丙烯醛的测定，方法检出限为1.12μg/kg，定量限为3.92μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与 再现性的基本方法 3术语和定义 3.1 PET效应photoelectrontransfereffect 指光致电子转移效应，即在光的诱导下，电子进行分子内或分子间转移的现象。当入射光照射探针 分子，由于电子从供体转移到激发态荧光团，供体分子不发射或仅发射微弱荧光。当探针与分析物结合 后，光诱导的电子转移被阻断，荧光团就会恢复荧光发射。 4原理 N-乙酸甲酯-4-巯基-1，8-萘酰亚胺中的巯基对萘酰亚胺荧光母核具有PET效应，其本身荧光十分 微弱；而当丙烯醛存在的情况下，N-乙酸甲酯-4-巯基-1，8-萘酰亚胺的巯基与丙烯醛通过迈克尔加成 反应形成加合产物，使得PET效应被抑制，加合物在波长380nm发射光激发下产生强荧光，峰值在510 nm波长处，其荧光强度在固定条件下与待测样品中丙烯醛浓度成正比，使用带荧光检测器的酶标仪检 测，外标法定量。荧光探针法测定丙烯醛的原理见图1。 全国团体标准信息平台 T/ZSSP0021—2022 2 无荧光 强烈荧光 图1荧光探针法测定丙烯醛的原理图 5试剂和材料 5.1试剂 5.1.1除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 5.1.24-溴-1，8-萘二甲酸酐（分析纯）。 5.1.3甘氨酸（分析纯）。 5.1.4三乙胺（分析纯）。 5.1.5乙醇（分析纯）。 5.1.6盐酸（分析纯）。 5.1.7对甲苯磺酸（分析纯）。 5.1.8甲醇（分析纯）。 5.1.9九水合硫化钠（分析纯）。 5.1.10二甲基亚砜（DMSO，分析纯）。 5.1.11柠檬酸（分析纯）。 5.1.12磷酸氢二钠（分析纯）。 5.1.13丙烯醛（分析纯）。 5.2荧光探针的制备 将554mg4-溴-1，8-萘二甲酸酐和165mg甘氨酸、252mg三乙胺在80℃的乙醇回流磁力搅拌 反应6h，反应完成后冷却至室温，向反应液中加入2.5mL1M盐酸溶液调节pH至白色沉淀析出，经 抽滤得到的固体分别用10mL水和乙醇进行洗涤，得到的白色固体即为N-乙酸基-4-溴-1，8-萘酰亚胺； 室温下，将167mgN-乙酸基-4-溴-1，8-萘酰亚胺和600mg九水合硫化钠溶解于5mLN，N-二甲基甲 酰胺中搅拌反应24h，反应结束后将反应液倒入20mL水中，并用1M盐酸水溶液调节pH至2，有黄 色沉淀析出。经抽滤得到的固体用水洗涤五遍后，得到的黄色固体即为N-乙酸基-4-巯基-1，8-萘酰亚 胺（Pr-ACR），冷冻干燥，置于-20℃冰箱中备用。 5.3试剂配制 5.3.1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH为2.2，1mmol/L，15.198g一水合柠檬酸和1.955g十二水合 磷酸氢二钠溶解于水中，再用250mL容量瓶定容。 5.3.2探针母液：2.15mgPr-ACR溶于0.5mLDMSO中，制成浓度为150mmol/L探针母液，母液要 现配现用。 全国团体标准信息平台 T/ZSSP0021—2022 35.3.3探针工作液：移取50μLPr-ACR母液加入到5mL容量瓶中，用4.3.1的缓冲溶液定容到5mL， 工作液要现配现用。 5.4标准品 丙烯醛标准品（C3H4O,CAS号：107-02-8）：纯度大于98.0%。 5.5标准溶液的配置 用水配制成丙烯醛浓度为30μmol/L的溶液，再用水稀释混匀得到一系列浓度的标准溶液（0 μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、18μmol/L、24μmol/L、30μmol/L）。 6仪器设备 6.1.1酶标仪（带荧光检测器，Ex250-600nm，Em280-600nm)。 6.1.296孔板（黑色）。 6.1.3粉碎机(细度30-100目）。 6.1.4天平：感量0.00001g。 6.1.5移液枪（1μL-10μL、10μL-100μL和100μL-1000μL）。 6.1.6常规玻璃仪器。 6.1.7离心机（12000转/分，14000×g)。 7试验步骤 7.1准曲线的绘制 移取100μL4.3.3中的探针工作液到96孔板中，再加入50μL4.5中不同浓度的丙烯醛标准液， 使丙烯醛浓度分别为0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L， 摇匀，并置于25℃下反应90min后，置于酶标仪中进行荧光检测，读取波长510nm处的荧光强度值 （激发波长为380nm），其荧光发射光谱图见附录A。 7.2样品的制备 将1g磨碎的食品粉末加入到15mL离心管中，加入5mL水，搅拌均匀并超声提取20min，再用 离心机在10000r/min的转速下离心20min，收集上清液。离心管中的沉淀物质再用2mL水按上述 操作重复提取两次，合并3次提取得到的上清液，定容到10mL，备用。 7.3样品的测定 移取100μL4.3.3中的探针工作液到黑色96孔板中，再加入50μL6.2中的样品提取液，摇匀， 置于25℃下反应90min后，用酶标仪进行荧光检测，读取波长510nm处的荧光强度值（激发波长为 380nm），每次处理重复3次。 7.4空白实验 全国团体标准信息平台 T/ZSSP0021—2022 4除不称取样品外，均按照上述测定条件和步骤进行。 8试验数据处理 样品中丙烯醛的含量按以下公式计算： x=56.06×C×V m……………………………………（1） 式中： x——样品中丙烯醛的含量，毫克/千克（mg/kg)； 56.06——丙烯醛的摩尔质量； C——样品液中丙烯醛的摩尔质量浓度，微摩/升（μmol/L)； V——被测样品的总体积，毫升（mL）； m——称取样品的质量，克（g）。 计算结果以重复性条件下获得的3次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 9精密度 9.1一般规定 本文件的精密度按照GB/T6379.2的规定确定，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。 9.2重复性 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 9.3再现性 在再现性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 10试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内容： ——试验对象； ——所使用的标准； ——所使用的方法； ——结果； ——观察到的异常现象； ——试验日期。 全国团体标准信息平台 T/ZSSP0021—2022 5附录A （资料性） 荧光发射光谱图 图1荧光探针Pr-ACR与不同浓度丙烯醛（从下至上，浓度依次为0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、 3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L、10μmol/L） 混合后荧光发射光谱图的变化情况（左）