ICS 65. 020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28974—2012 马铃薯A病毒检疫鉴定方法 纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 Detection and identification of potato virus ANanoparticles-enlarged in colloidal gold immunochromatographic assay 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28974—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：邹明强、张帆、李锦丰、陈艳、戴华、田世民、马吉湘、金涌。 I GB/T 28974—2012 引言 本文件的发布机构提请注意，申明符合本文件时，可能涉及到6.4.3、B.4与增敏试剂相关的专利 的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 该专利持有人：中国检验检疫科学研究院 联系人：邹明强 地址：北京市朝阳区高碑店北路甲3号中国检验检疫科学研究院邮编：100123 请注意除上述专利外，本文件的某些内容能够仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这 些专利的责任。 GB/T28974—2012 马铃薯A病毒检疫鉴定方法 纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 SA 1范围 本标准规定了用纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法检测马铃薯A病毒的原理、实验步骤及结果判 定等。 本标准适用于植物及其产品组织中马铃薯A病毒的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T23629—2009引进植物病原生物安全控制技术要求 GB/T23632—2009进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程 3. 马铃薯A病毒基本信息 中文名：马铃薯A病毒 学名：potato virusA 缩写：PVA 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。 马铃薯A病毒的其他信息参见附录A。 方法原理 基于胶体金免疫层析双抗体夹心检测法原理，采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规 马铃薯A病毒。 5仪器设备、用具及试剂材料 5.1仪器设备 天平（感量，1/10000g）、离心机、组织捣碎机、低温冰箱等。 5.2用具 微量移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、研钵、离心管等。 1 GB/T28974—2012 5.3试剂材料 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定马铃薯A病毒试剂材料（见附录B）。 6实验步骤 6.1生物安全与废弃物处理 实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489的规定进行操作，实验废弃物按照 GB/T23629—2009中5.7进行处理。 6.2样品制备 称取1g植物或其产品组织，加人2mL样品提取缓冲液用研钵研磨，然后4℃下3000g～5000g 离心10min，取上清液制备成一个样品。 6.3样本存放 制备的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存，应置一70℃以下，避免反复 冻融。 6.4病毒检测 6.4.1检测步骤 取同一批次胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条（即开即用），置于平整的台面上，向样品垫中分别 加入被检样品、阳性对照和阴性对照各100μL，每个试验同时做平行。室温放置15min，观察检测线和 质控线条带。 6.4.2质量控制 质控线条带出现颜色，阳性对照检测线条带出现颜色，阴性对照检测线条带不出现颜色，检测结果 有效。如果质控线条带不出现颜色，或阳性对照检测线条带不出现颜色，或阴性对照检测线条带出现颜 色，出现任何一种现象以上者，说明检测结果无效，另选一批次试纸条重新按6.4.1操作。 6.4.3增敏实验 向检测线没有产生颜色条带的试纸条样品垫上加人100μL的PBST缓冲溶液进行清洗，反复清洗 3次，每次1min，然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加人30μL增敏试剂，室温反应5min～8min后， 观察检测线条带颜色， 6.4.4结果判定 检测线条带出现颜色，判定为阳性；检测线条带不出现颜色，判定为阴性。 注：增敏前条带颜色为红色，增敏后因为氧化还原反应使条带颜色变为黑灰色。 7结果的确认 可疑阳性样品应采用马铃薯A病毒RT-PCR检测方法进行确认。 2